甜瓜白粉病抗病基因的定位及候选基因分析

李 冰赵玉龙朱强龙张志鹏樊 超栾非时*高 鹏*

（1农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030；3黑龙江省农业科学院海南基地，海南三亚 572000）

甜瓜白粉病抗病基因的定位及候选基因分析

李 冰1，2赵玉龙1，2朱强龙1，2张志鹏1，2樊 超2，3栾非时1，2*高 鹏1，2*

（1农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；2东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030；3黑龙江省农业科学院海南基地，海南三亚 572000）

以甜瓜高抗白粉病自交系MR-1为母本，易感白粉病自交系Top Mark为父本，构建BC1P2和F2群体，经13个国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主鉴定，2015年东北农业大学设施园艺工程中心的白粉病发病病菌为P. xanthii生理小种1，甜瓜MR-1对P. xanthii生理小种1的抗性由单显性基因控制。通过对266个F2分离群体的抗病性鉴定和CAPS标记分析，采用复合区间作图法对甜瓜抗白粉病性状进行QTL分析，最终构建了1张包含203个CAPS标记的甜瓜遗传连锁图谱，并将抗病基因PXR定位在第12号染色体上M12-GH和M12-TE 2个标记之间，该基因与两侧翼标记间的距离分别为0.63 cM和0.42 cM，两侧翼标记间在甜瓜参考基因组上对应的物理距离为303 kb，该区域内含有60个预测基因，其中10个基因含有非同义单碱基突变。10个基因荧光定量分析结果显示，在抗病与感病甜瓜表达量存在较大差异的4个基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457为甜瓜白粉病抗病候选基因。

甜瓜；白粉病；CAPS；抗病基因

甜瓜（Cucumis meloL.）起源于非洲和亚洲热带地区，广泛栽培于世界范围内温带至热带地区（林红梅 等，2013），据FAOSTAT和中国农业统计资料最新数据显示，2014年全球甜瓜总产量达到0.296亿t，我国2015年的甜瓜总产量约为0.153亿t。白粉病作为甜瓜、黄瓜、南瓜等葫芦科作物上广泛发生的一种世界性真菌病害，在露地和保护地栽培中均有发生，发病时叶片表面形成不规则大片病斑，严重时全叶或茎蔓上遍布白粉，叶片脆硬干枯甚至丧失光合能力，造成植株早衰（谷医林，2013），从而严重影响葫芦科作物的品质和产量，是危害甜瓜生产的主要病害之一。目前，已报道的最常见的引起白粉病的病原菌是单囊壳属的单囊壳菌Podosphaera xanthii（原名为Sphaerotheca fuliginea）和白粉菌属的二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum（原名为Erysiphe cichoracearum）（Kíř stko vá et al.，2009）。同二孢白粉菌相比，单囊壳菌主要发生在全球范围内的高温高湿度地区，具有生理小种多、发病范围广的特点（Mccreight，2003）。根据对不同鉴别寄主侵染的反应，P. xanthii被分为很多生理小种，包括小种0、1、2 US、2 France（2F）、3、4、5、N1（race 6）、N2（race 7）、N3和N4（Hosoya et al.，1999，2000）。随着鉴别寄主数量的增加和研究的不断深入，陆续有新的生理小种被发现（Mccreight，2006；Hoytaek et al.，2016）。美国发病较多的为P. xanthii生理小种1、2和3（Mccreight，2003），法国则是P. xanthii生理小种0、4和5（Bardin et al.，1999）。 在我国最普遍发生的是P. xanthii小种1和2F（卢浩 等，2015），这两种生理小种在黑龙江省均有报道（马鸿艳 等，2011）。

白粉病病原菌增殖快，传播迅速，致死率高，防治困难。抗真菌药物的施用虽然有一定的作用，但是并不能完全抑制白粉病的发生，而且过多的施用会引起白粉病生理小种的耐药性甚至突变，也会对环境造成危害（Hollomon et al.，2002）。植物抗病育种是控制病害发生和减少药剂使用量的有效途径，深入了解甜瓜白粉病抗病遗传机制是甜瓜白粉病抗性育种工作的基础和首要任务，也是分子标记等生物技术辅助育种的基础。针对P. xanthii小种1和小种2F的抗病基因研究已有多篇报道。甜瓜品种PI 414723中的抗病基因Pm-7对P. xanthii生理小种 1具有抗性（Pitrat，2006）；甜瓜品种WMR 29中的抗病基因Pm-w对P. xanthii生理小种1和2具有抗性；抗病基因Pm-1抗P. Xanthii生理小种1，被定位在 LGⅨ上（Teixeira et al.，2008）；甜瓜品种PI 414723中的抗病基因Pm-x对P. Xanthii生理小种2F具有抗性（Pitrat，1990）；甜瓜品种K7-1中的抗病基因Pm-2F被定位在LG Ⅱ上（Zhang et al.，2012）。MR-1是白粉病鉴别寄主之一，对多种白粉病生理小种均表达出抗性，但是其中的抗病基因还未被准确定位。

本试验以国际甜瓜白粉病生理小种通用鉴别寄主中高抗品种MR-1为母本，以高感白粉病品种Top Mark为父本，配制BC1P2和F2群体，开发CAPS分子标记，构建甜瓜分子遗传图谱，并对甜瓜白粉病抗病基因进行QTL分析。获得2个与白粉病抗病基因相连锁的CAPS标记。运用荧光定量PCR方法对预测候选基因在亲本中的表达量进行差异性分析，从而对甜瓜白粉病抗病基因进行预测，为甜瓜白粉病抗病基因的克隆与转基因研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料

选用国际甜瓜白粉病生理小种通用鉴别寄主中高抗品种MR-1为母本，以高感白粉病品种Top Mark为父本，杂交获得到F1，将F1严格自交授粉获得F2种子，F1与Top Mark回交获得BC1P2。本试验用于白粉病生理小种鉴定的13种国际鉴别寄主分别为：Iran H、Top Mark、V é drantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6和Nantais Oblong。供试种子均由东北农业大学园艺园林学院西甜瓜分子遗传育种研究室提供。

2015年5月，将MR-1、Top Mark、F1、BC1P2、F2群体和13个鉴别寄主分别定植于东北农业大学设施园艺工程中心（44°04′N，125°42′E），亲本与F1采用随机区组方式各定植15株，BC1P2种植45株，13个鉴别寄主各种植5株，采用完全随机方式定植266株F2群体。株距50 cm，行距80 cm，均采用常规栽培管理方式和水肥供给。

1.2白粉病菌接种和抗性调查

在盛花期采集同年同地区严重侵染甜瓜植株的白粉病菌，配制浓度为106个·mL-1的孢子悬浮液，均匀喷洒在植株叶片上（Zhang et al.，2011）。接种10 d后对亲本、F1、BC1P2、F2和13个鉴别寄主的白粉病侵染情况进行调查，取每株植株从下至上10片真叶分别进行观察记录与拍照留存。根据病斑分布情况将每片叶片的发病情况分为6级：0级，无病斑；1级，没有明显的病斑；2级，低级程度侵染；3级，中等程度侵染；4级，严重侵染；5级，病斑分布整片叶子（图1），并计算每株单株的发病指数（PDI）。PDI＜40的植株为高抗，PDI＞60的植株为感病，40≤PDI≤60的植株为中抗，其中高抗植株与中抗植株均记为抗病。

图1叶片病斑分级标准

调查统计13份鉴别寄主的发病情况，并参考魏尊苗等（2011）鉴定葫芦科白粉病生理小种的标准对本试验中的甜瓜白粉病生理小种进行鉴别。

1.3 DNA的提取

分别采集P1、P2、F1、F2群体单株的幼嫩叶片保存于-80 ℃冰箱中，采用改良CTAB法（Allen et al.，2006）提取叶片的基因组DNA。DNA的质量和浓度通过1%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计进行检测（SMA 3000，Plextech，中国深圳）。

1.4 CAPS分子标记的开发与筛选

将MR-1与Top Mark的基因组重测序数据与甜瓜DHL92参考基因组数据进行比对（Li et al.，2009），利用东北农业大学西甜瓜分子遗传育种研究室自编Perl语言脚本提取位于SNP位点两端约500 bp的片段序列作为候选SNP位点序列。通过SNP2CAPS软件结合7种不同的限制性内切酶（EcoR I、Hind Ⅲ、PstI、BamH I、XbaI、XhoI和Hinf I）对候选SNP序列进行CAPS酶切位点信息的分析，在酶切位点上、下游100～500 bp设计引物，尽可能让引物均匀地分布在12条染色体上，引物设计使用Primer premier 6.0软件并送至上海生工生物工程有限公司进行合成。

将MR-1、Top Mark与F1利用引物进行降落PCR（Touchdown PCR）扩增，PCR反应体系（10 μL）为：60 ng基因组DNA，上下游引物各1 pmol，1.5 mmol·L-1dNTPs，10×Taq缓冲液和1 U的Taq酶；PCR扩增程序为：94 ℃预热7 min，共30个循环，每个循环包括94 ℃变性1 min，60 ℃至45 ℃每个循环减少0.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃最终延伸10 min。

选择相应的限制性内切酶在37 ℃酶切PCR产物3～4 h，酶切反应体系包含：5 μL PCR产物，3 U限制性内切酶，1 μL缓冲液和9 μL ddH2O。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物多态性。

1.5 QTL分析

将筛选出的具有多态性的203对CAPS标记用于F2群体的基因型分析，经过降落PCR、酶切，以及1%琼脂糖凝胶电泳，将母本带型记为2，父本带型记为0，杂合带型记为1，缺失带型记为-1。利用QTL ICImapping v4.0软件构建甜瓜遗传连锁图谱（LOD=3.0），并进行QTL分析（LOD=4.0）。

1.6 RNA的提取与cDNA的合成

利用Trizol（Invitrogen USA）法提取MR-1与Top Mark叶片RNA。RNA的质量和浓度同样通过1%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计进行检测，检测合格的RNA利用东洋纺反转录试剂盒（First Strand cDNA Synthesis Kit，TOYOBO，JAPAN）进行第1条链cDNA的合成，并于-80 ℃条件进行保存。

1.7荧光定量分析

根据CAPS分子标记所设计的引物在甜瓜参考基因组中的位置和最新版本的基因组注释信息，截取该区域内的所有推测基因，并分析这些基因在两亲本间的单核苷酸多态性。筛选其中具有非同义单核苷酸多态性（nsSNP）的基因进行实时荧光定量分析（qRT-PCR）。基因编码全长序列来源于甜瓜基因组数据库（https：//melonomics.net），再根据所用的荧光定量试剂盒说明书要求，使用Primer premier 6.0软件设计引物（表1）并送至上海生工生物工程有限公司合成。利用荧光定量试剂盒（RealMaster Mix SYBR Green，TIANGEN）进行所有样品的qRT-PCR反应，所有样本均进行3次生物学重复和3次技术重复，配制与加样过程均在冰上进行。qRT-PCR反应体系为：1 μL稀释的cDNA样品，上、下游引物各1 μL，9 μL 2.5× RealMaster Mix反应液，加8 μL RNase-free ddH2O至20 μL。qRT-PCR扩增程序为：95 ℃预变性60 s；40个循环，每个循环包括95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。扩增反应后通过溶解曲线分析扩增产物的特异性。采用2-ΔΔCT法（Livak & Schmittgen，2001）计算相对表达量。

表1荧光定量分析引物

2 结果与分析

2.1甜瓜白粉病发病生理小种鉴定

根据13个甜瓜白粉病鉴别寄主的抗感鉴定结果与文献中白粉病生理小种鉴定标准，2015年东北农业大学设施园艺工程中心的白粉病发病特征符合P. xanthii生理小种1的发病特征，即认为本试验中所有抗感分级及分离群体抗感鉴定均针对P. xanthii生理小种1。

2.2分离群体抗感反应鉴定

在抗感反应鉴定中（表2），母本MR-1与F1中未发现或发现少量白粉病斑，表现出较强的抗病性；而父本Top Mark被白粉病严重侵染，表现出较强的感病性；BC1P2中抗病单株21株，感病单株24株；F2群体中抗病单株为201株，感病单株为65株，经χ2检验符合3∶1的分离比例（P＞0.05）。由此可知，MR-1中抗白粉病P. xanthii生理小种1的基因为显性单基因。

表2各世代群体对白粉病的抗感反应

2.3甜瓜遗传连锁图谱的构建及QTL分析

利用203对CAPS引物对266个F2单株进行基因型分析，构建了一张包含12条连锁群的遗传连锁图谱，覆盖基因组长度1 865.32 cM，标记图上位置与物理图谱位置一一对应，标记间平均距离为9.19 cM。其中第9号染色体图距最长，为186.22 cM，包含19个CAPS标记；第1号染色体图距最短，为69.28 cM，包含18个CAPS标记（表3、图2）。

表3甜瓜遗传连锁图谱上的分子标记分布

2.4白粉病抗病基因的染色体定位

基于本试验获得的甜瓜遗传连锁图谱和白粉病抗病表型鉴定结果，运用QTL ICIMapping v4.0 软件对白粉病抗病基因进行QTL分析，共检测到1个与甜瓜白粉病抗病相关的QTL，命名为PXR（图2），PXR位于第12号染色体M12-GH与M12-TE标记之间，与两侧翼标记间的距离分别为0.63 cM和0.42 cM。LOD值为32.5，可解释78.26%的表型变异率，加性效应为0.399 9，显性效应为0.518 0。由于遗传距离较小和贡献率较高，说明PXR与两侧翼的标记连锁紧密且可以作为主效基因进行下一步基因挖掘。

2.5候选基因确定及荧光定量分析

标记M12-GH和M12-TE在染色体上的位置相距较近，分别位于第12号染色体22 623 096 bp和22 926 554 bp处，因此初步将PXR定位在12号染色体上物理距离303 kb的范围内，根据该区段内的参考基因组的注释信息及两亲本间序列的单核苷酸多态性信息，发现该区域内已注释的甜瓜相关基因有60个，其中10个基因（MELO3C002434、MELO3C002437、M E L O 3 C 0 0 2 4 3 9、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 0、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 1、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 3、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 5、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 7、MELO3C002457、MELO3C002465）上包含了32个nsSNPs，并推测这10个基因为候选基因（表4）。经过基因功能注释，这些基因为锚蛋白重复家族蛋白、热休克蛋白、抗坏血酸氧化酶等。

图2甜瓜F2群体构建的遗传连锁图谱

在亲本中对10个基因进行荧光定量分析和表达量差异分析。结果表明（图3），4个基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457在抗白粉病甜瓜MR-1中的表达量均大于同期感白粉病甜瓜Top Mark，并存在较大差异，但其他基因的表达量无明显差别。由此推测：MELO3C002434、M E L O 3 C 0 0 2 4 3 7、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 1、MELO3C002457更有可能是白粉病抗病基因。

表4基因功能注释结果

图3 10个基因在亲本中表达量差异分析

3 结论与讨论

甜瓜的高产量与高质量是育种的主要目标，白粉病的发生对甜瓜的产量与品质产生了很大的危害，培育抗白粉病的甜瓜品种是控制甜瓜白粉病发生的有效途径，为了从抗病材料中进行抗病基因的挖掘，首先要对该抗病材料的抗病基因的遗传特性进行研究。甜瓜不同抗病材料中抗病基因的抗病机制与遗传位置不同，遗传模式也有所差别（宁雪飞 等，2013）。通常有单显性基因（Liu et al.，2010）、不完全显性基因（王建设 等，2005）、主效基因和微效基因（Barnes & Epps，1956）、多基因（Epinat et al.，1993）等。近年的研究结果大都符合单显性基因控制白粉病抗性这一理论，部分研究出现不符合单基因孟德尔遗传的抗病分离群体可能是由于存在偏分离现象或受到环境等因素的影响（Wang et al.，2011）。本试验结果也支持甜瓜白粉病抗性是由单显性基因控制的理论。但是即使同一种甜瓜材料，随着生理小种的不同，抗病基因与遗传模式也不尽相同。

2016年于东北农业大学向阳农场定植相同群体，但13个鉴别寄主的鉴定结果表明，当年当地发病白粉病病菌为P. xanthii生理小种2F，同本试验2015年该地区发病生理小种不同，相同亲本MR-1与Top Mark杂交得到的F1表现出明显的感病状态，并且F2群体感病植株与抗病植株分离比例约为2∶1，不符合单基因模型，表明P. xanthii生理小种2F的抗病基因为隐性遗传，但基因遗传模型比较复杂或还受到白粉病其他生理小种的干扰。由此推断，本试验抗病亲本MR-1中同时存在P. xanthii生理小种1和2F的抗病基因，且基因数量、位置和遗传模型不同。

由于常规的PCR和Northern blot难以对基因的表达差异进行准确和快速的分析，人们通常选用qRT-PCR进行候选基因的确定。Xu等（2015）采用qRT-PCR对20个黄瓜果肉厚度的候选基因进行差异性表达量分析，发现Csa2M058670.1基因在父母本之间表达量差异很大，从而确定其为黄瓜果肉厚度候选基因。Nie等（2015）在对pm5.1基因在亲本间进行荧光定量分析时发现，这个基因与植物细胞壁厚度有关，因此在接种白粉病菌后表达量的改变说明pm5.1通过调控细胞壁厚度从而阻碍白粉病菌的入侵。本试验对10个基因进行qRT-PCR分析，比较它们在抗感甜瓜品种中的表达量差异，得到了4个差异性表达的基因作为甜瓜白粉病抗病的候选基因（MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457）。

在4个候选基因中，MELO3C002434与MELO3C002441为含锚蛋白重复序列的相关基因。前人在锚蛋白重复序列基因与植物抗病与抗逆的关系中有一些相关研究，水稻XB3是一个泛素连接酶E3，其中含有RING指结构域和锚蛋白重复序列，它与水稻中响应生物胁迫信号的类受体激酶XA21相结合，调节水稻对白叶枯病的抗性。拟南芥中含有的XBAT35基因中含有锚蛋白重复序列，通过参与乙烯信号的负调过程，从而对胁迫产生免疫机制（刘士扬，2014）。MELO3C002457为类似过氧化物酶基因，在低温胁迫过程中，起着清除自由基的作用，避免自由基大量积累损害膜系统（沈丽雯，2015）。侯建设等（2009）通过热激处理青椒，来提高过氧化物酶等的活性，从而显著降低低温冷藏过程中的冷害。而在基因功能注释的结果中，MELO3C002437并未显示出具有已报道的基因功能，所以对候选基因的确认还需要进一步的研究。

本试验对白粉病抗病基因定位的研究表明，2015年东北农业大学设施园艺工程中心的白粉病优势生理小种为P. xanthii生理小种1，甜瓜高抗白粉病品种MR-1对P. xanthii生理小种1的抗性由单显性基因控制。经过QTL和qRT-PCR分析，得到了1个303 kb的基因组区域，并初步确认该区域内的4个基因为甜瓜白粉病抗病候选基因，为下一步的基因克隆以及基因功能验证提供了理论依据。

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Melon Powdery Mildew Resistance Gene Location and Candidate Gene Analysis

LI Bing1，2，ZHAO Yu-long1，2，ZHU Qiang-long1，2，ZHANG Zhi-peng1，2，FAN Chao2，3，LUAN Fei-shi1，2*，GAO Peng1，2*

〔1KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops（NortheastRegion），Ministryof Agriculture，Harbin150030，Heilongjiang，China；2HorticultureandLandscapeArchitectureCollegeofNortheast AgriculturalUniversity，Harbin150030，Heilongjiang，China；3HainanBaseofHeilongjiangAcademyofAgricultural Sciences，Sanya572000，Hainan，China〕

BC1P2and F2generations were constructed by crossing a melon inbred line ‘MR-1’ highlyresistant to powdery mildew（Podosphaera xanthii）as female parent，and a melon inbred line ‘Top Mark’highly susceptible to powdery mildew as male parent. The race ofP. xanthiiwas identified as race 1 according to the infecting action of 13 international differential hosts for melon powdery mildew，and the resistance to powdery mildew was controlled by a single dominant gene based on the population genetic analysis of BC1P2and F2. Through evaluating the resistance in 266 individuals of F2，the genotype analysis using cleaved amplified polymorphic sequences（CAPS），and quantitative trait loci（QTL）analysis using composite interval mapping method（CIM）for locating the locus resistant to powdery mildew，a genetic linkage map of melon contained 203 CAPS was constructed. One QTL namedPXRwas detected on chromosome 12 between the 2 CAPS markers，M12-GH and M12-TE，which were tightly linked to the gene resistant to powdery mildew with the genetic distances of 0.63 cM and 0.42 cM，respectively. Sixty putative genes were located in the region with the length of 303 kb between the 2 flanking markers. Ten of them with non-synonymous single nucleotide polymorphism（nsSNP）were further identified as candidate genes resistant to powdery mildew in melon. The results suggested that 4 genes（MELO3C002434，MELO3C002437，MELO3C002441，andMELO3C002457）showed bigger differences in expression of disease resistance and susceptible might be the candidate genes resistant to powdery mildew in melon.

Melon；Powdery mildew；CAPS；Disease resistance gene

李冰，女，硕士研究生，专业方向：甜瓜分子遗传育种，E-mail：1332142074@qq.com

*通讯作者（Corresponding authors）：栾非时，女，教授，博士生导师，专业方向：西甜瓜分子遗传育种，E-mail：luanfeishi@neau.edu.cn；高鹏，男，副研究员，硕士生导师，专业方向：西甜瓜分子遗传育种，E-mail：gaopeng_neau@163.com

2016-12-22；接受日期：2017-03-13

国家自然科学基金项目（31301791，31672177），东北农业大学“学术骨干”计划项目（16XG06），东北农业大学“青年才俊”计划项目（14QC09），国家西甜瓜产业技术体系-分子育种岗位项目（CARS-26-02）