烟草花叶病毒山西番茄分离物的全基因组序列测定及分析

庞小静赵慧琪王德富刘 勇牛颜冰*

（1山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南长沙410125）

烟草花叶病毒山西番茄分离物的全基因组序列测定及分析

庞小静1赵慧琪1王德富1刘 勇2牛颜冰1*

（1山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南长沙410125）

为明确山西省晋中市侵染番茄的病毒种类，采用双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）技术和非序列依赖PCR扩增（sequence-independent amplification，SIA）方法对感病番茄进行分子鉴定。序列测定及分析发现，具有花叶、卷曲症状的番茄为烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）所侵染。进一步克隆TMV番茄分离物（TMV-SXFQ）的全基因组序列，得到TMV-SXFQ（GenBank登录号为JX993906）全长为6 394 bp，含4个开放阅读框（open reading frame，ORF）。序列比对分析表明，TMV-SXFQ与烟草花叶病毒属其他分离物的同源性为86.3%～99.6%；系统进化分析表明，TMV-SXFQ与韩国分离物IM聚为一簇、亲缘关系最近。

番茄；病原鉴定；烟草花叶病毒；序列分析

番茄（Solanum lycopersicumL.）为茄科番茄属一年生草本植物，具有生津止渴、健胃消食、清热解毒、补肾利尿等功效。作为广泛种植的蔬菜作物之一，番茄对我国的农业经济具有重要影响。据统计，近年来我国每年番茄产量可达5 000万t以上，2015年更是达到了5 594万t，占全国蔬菜总产量的7.1%；2016年继续增加，全国番茄种植面积约110万hm2（1 648万亩），总产量约5 686万t（马兆红，2017）。但从20世纪60年代起番茄病毒病在我国广为传播，严重影响了番茄的产量和品质。病毒病作为威胁番茄生产的主要病害之一（周雪平和钱秀红，1996），造成某些地区春播番茄减产30%左右，而对夏、秋播番茄影响更大，严重者甚至绝产，经济损失巨大（冯兰香 等，1987；周建国 等，2013）。目前，侵染番茄的病毒主要有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草卷叶病毒（Tobacco leaf curl virus，TLCV）、苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）、番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）、番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）等（张桂芝，2011；Zhao et al.，2013；赵黎明 等，2014）。

晋中地区作为山西省番茄主产区之一，笔者于2012～2013年在对番茄种植基地进行调研时发现，番茄病毒病在山西省晋中地区暴发严重，造成了番茄产量和品质的严重下降，对番茄产业发展以及当地农民的经济收入影响颇大。为了明确山西省晋中市感病番茄的主要病毒种类，选择表现花叶、卷曲症状较严重的太谷县番茄种植田块进行深入调查和分析，利用双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）技术（Tzanetakis & Martin，2008）和非序列依赖PCR扩增（sequence-independent amplification，SIA）方法（牛颜冰 等，2014）对采集的番茄疑似病样进行鉴定，经序列测定发现晋中地区的番茄被烟草花叶病毒（TMV）所侵染，并将其命名为TMV-SXFQ；进一步对TMV-SXFQ进行全基因组克隆及分析，明确其分类地位，以期为防御和控制番茄病毒病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料

番茄疑似病样于2012年7月采自山西省太谷县番茄种植田块，病株叶片表现出褪绿黄化、卷曲等症状（图1），采集后-80 ℃保存备用。

图1山西省太谷县番茄植株田间感病症状

1.2主要试剂

莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV）和RNasin核酸酶抑制剂购自Promega公司；克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司；Taqplus DNA polymerse、Taq DNA polymerse和DNA回收试剂盒购自Sangon Biotech公司，CF-11购自Whatman公司。

1.3试验方法

1.3.1 生物学接种试验 取少许疑似番茄病样叶片，用磷酸缓冲液充分研磨，将其汁液用石英砂摩擦接种于指示植物烟草上，观察症状。

1.3.2 植物病原双链RNA（dsRNA）的提取 选取症状明显的花叶和卷曲叶片，参照牛颜冰等（2011a，2011b）、Tzanetakis和Martin（2008）的方法，采用CF-11纤维素分离病毒dsRNA。首先将10 g病样用液氮充分研磨，加入10～15 mL提取液，充分混匀，4 ℃、4 800 r·min-1离心5 min，取上清液，加入等体积酚/氯仿去除蛋白；然后用CF-11去分离dsRNA，加入1/10体积3 mol·L-1NaAC和3倍体积的无水乙醇沉淀dsRNA；最后用75%乙醇洗涤、干燥，溶于ddH2O，-20 ℃保存备用。

1.3.3 非序列依赖性PCR（SIA）和病毒全基因组扩增 以提取的病样dsRNA为模板，利用随机引物XTN269反转录获得病毒cDNA模板，然后再利用引物XTN177进行SIA检测，初步确定感染番茄的病毒种类，具体反应体系和程序参照牛颜冰等（2015）的方法进行。

为进一步确定侵染番茄的病原种类，根据SIA结果以及NCBI的GenBank中已收录的其他TMV分离物保守区设计了6对特异引物（表1）进行病毒全基因组扩增，其中引物TMV-F1/TMV-R1、TMV-F2/TMV-R2、TMV-F3/TMV-R3扩增病毒5′端非编码区及ORF1，引物TMV-F4/TMV-R4、TMV-F5/TMV-R5扩增病毒ORF2和ORF3，引物TMV-F6/TMV-R6扩增病毒ORF4及3′端非编码区；以健康番茄作为阴性对照。

1.3.4 PCR产物克隆及序列分析 利用琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，采用DNA纯化试剂盒回收后将其与PMD18-T Vector进行连接，然后用大肠杆菌DH5α转化，通过菌落PCR鉴定，随机选取3个阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序。利用GenBank对所得序列进行BLAST检索，再用DNASTAR中的SeqMan软件对测序结果进行拼接。利用DNAMAN软件对所得序列与已报道的TMV分离物进行核苷酸序列、氨基酸序列的同源性和相似性比较，并运用MEGA 5.2软件构建系统进化树。

表1 PCR扩增所用引物序列

2 结果与分析

2.1生物学接种试验结果

接种14 d后，在指示植物烟草上观察到花叶症状（图2），初步证明该番茄病害可能是由病毒引起的。

图2生物学接种试验结果

2.2 dsRNA提取和SIA检测

将提取的病样dsRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，得到大小约6 000 bp的条带；健康对照无条带出现。然后再选用随机引物XTN269/ XTN177，以提取的dsRNA为模板进行SIA检测，得到大小为963 bp的条带；健康对照仍未扩增出任何条带（图3）。经克隆、测序和序列比对发现该片段与TMV相似性最高，初步揭示山西省晋中市番茄可能被TMV所侵染，并将该分离物命名为TMV-SXFQ。

2.3 TMV-SXFQ全基因组克隆及分析

2.3.1 TMV-SXFQ全基因组序列的克隆 为了进一步确定山西省晋中市番茄所感染的病毒病病原是否为TMV，以提取的病样dsRNA为模板，采用6对特异引物进行全基因组克隆。结果得到的片段大小与预期相符，分别为1 062、1 300、1 247、1 409、1 353 bp和923 bp（图4），而健康对照未扩增出相应大小的片段。

图3 SIA扩增产物电泳检测结果

图4 TMV-SXFQ的PCR检测结果

2.3.2 TMV-SXFQ全基因组序列分析 经序列测定和拼接获得了TMV-SXFQ全基因组序列（GenBank登录号为JX993906），序列分析显示TMV-SXFQ全长为6 394 bp，含有4个开放阅读框（ORF），其中ORF1起始于69位核苷酸，终止于3 419位，编码1 116个氨基酸，产生分子量为129 kD的蛋白；ORF2是由ORF1超读产生，ORF1终止子为TAG，其后为CAATTA序列，这是烟草花叶病毒属病毒ORF1通读的典型特征，该结构增强了终止密码子的通读结构而产生较大的阅读框ORF2，ORF2终止于4 919位，含有4 851个核苷酸，编码1 615个氨基酸，产生分子量为181 kD的通读蛋白，129 kD及181 kD两个蛋白均与病毒的复制相关；ORF3由807个核苷酸组成，编码268个氨基酸，得到分子量为29 kD的移动蛋白（movement protein，MP）；ORF4含有480个核苷酸，编码159个氨基酸，得到分子量为17 kD的外壳蛋白（coat protein，CP）。TMV-SXFQ基因组5′ 端UTR和3′ 端UTR长度分别为68、203 bp（图5）。综合分析结果显示，TMVSXFQ与烟草花叶病毒属其他分离物的基因组结构基本一致。

图5 TMV-SXFQ基因组结构示意图

2.4 TMV-SXFQ序列相似性分析

将TMV-SXFQ全序列与来自中国、日本、韩国、澳大利亚、美国、西班牙等地区的17个烟草花叶病毒属分离物进行核苷酸序列、氨基酸序列同源性和相似性比较分析。结果表明（表2），TMVSXFQ分离物与其他TMV分离物的核苷酸序列同源性为86.3%～99.6%；其中与来自韩国的侵染本氏烟的分离物IM同源性最高，达99.6%；而与来自中国台湾的侵染矮牵牛的分离物pet-TW以及来自美国的分离物Ohio V同源性最低，为86.3%。对编码的129 kD、181 kD、移动蛋白（MP）、外壳蛋白（CP）进行氨基酸序列同源性分析，发现129 kD和181 kD复制相关蛋白与其他TMV分离物同源性分别为94.5%～99.4%、95.5%～99.6%，其中与来自中国山东的侵染本氏烟的分离物Jimo同源性最高，分别为99.4%、99.6%，与来自美国的分离物Ohio V同源性最低，分别为94.5%、95.5%；MP与来自韩国的分离物IM同源性最高，为99.6%，与TMV其他分离物同源性为88.0%～98.8%；CP与来自韩国的分离物IM、中国山东的分离物Jimo以及西班牙的分离物WT-L2同源性均为100%，与其他TMV分离物同源性为95.6%～99.4%。综合分析TMV编码的这4种蛋白中，CP最保守，129 kD和181 kD蛋白次之，MP变异最大；而TMV-SXFQ与Ohio V分离物同源性最低、亲缘关系最远。

表2 TMV-SXFQ与Tobamovirus中已报道的分离物核苷酸及氨基酸同源性比较结果

为了确定TMV-SXFQ编码变异最大的MP变异情况，将TMV-SXFQ的MP氨基酸序列与其同源关系比较高的5个分离物，即韩国分离物IM、中国山东分离物Jimo、中国贵州分离物Pingtan-2、中国山西分离物Shanxi以及西班牙分离物WT-L2的相应氨基酸序列进行比较分析，发现在MP蛋白的氨基酸序列中存在8个氨基酸变异，分别位于第18、52、135、225、228、244、248、260位（图6）。

2.5 TMV-SXFQ系统进化分析

图6 TMV-SXFQ与其同源关系比较高的5个分离物的MP氨基酸序列一致性分析结果

为了进一步研究TMV-SXFQ的起源与进化关系，利用MEGA 5.2软件与已报道的其他烟草花叶病毒属分离物构建氨基酸序列的系统进化树。从图7可以看出，TMV-SXFQ与其他TMV分离物形成一个大分支，其中与韩国分离物IM单独聚为一簇，亲缘关系最近，与中国台湾分离物pet-TW和美国分离物Ohio V亲缘关系最远；而TMVSXFQ与烟草花叶病毒属其他分离物如地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus，ReMV）和番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）的进化关系相对较远，这也进一步说明TMV-SXFQ为TMV分离物。

图7 TMV-SXFQ与已报道的烟草花叶病毒属分离物的氨基酸序列系统进化树

3 结论与讨论

植物病毒是危害作物的主要病原物之一，烟草花叶病毒属（Tobamovirus）病毒在世界各地均有分布，寄主范围也特别广泛，可侵染茄科、十字花科、葫芦科、豆科、藜科、木犀科、苋科、菊科、商陆科等36科逾300种植物（雷彩燕 等，2005；侯红琴 等，2008；黄永山和谭海文，2013；王德富等，2016）。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第八次分类报告，Tobamovirus有22个种和1个暂定种（Briddon et al.，2005），烟草花叶病毒作为烟草花叶病毒属的典型成员，早在1892年就被发现。目前TMV的株系很多，甚至在同一寄主上都会有不同的株系。过去，TMV株系主要依据其侵染植物的症状与寄主范围来划分。但是，随着分子生物学的发展，对其基因组序列进行扩增和比较分析，可以发现不同株系间的微小差异，从而在不同寄主植物上不断获得TMV新株系（雷彩燕 等，2005）。

本试验从山西省晋中市太谷县感病番茄中检测到烟草花叶病毒山西番茄分离物（TMV-SXFQ），进一步进行同源性和系统进化分析发现TMVSXFQ与烟草花叶病毒属其他分离物的同源性为86.3%～99.6%，其中CP最保守，MP变异最大；系统进化分析显示TMV-SXFQ与韩国分离物IM单独聚为一簇，亲缘关系最近。通过对TMV不同株系进行基因组结构及变异分析，可以为抗病毒基因工程提供一定的理论与技术支持，而TMV-SXFQ新株系全基因组的获得将为番茄病毒病的有效防治提供一定的参考依据。

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Complete Whole Genome Sequence Measure and Analysis of Tobacco mosaic virus Infecting Tomato in Shanxi

PANG Xiao-jing1，ZHAO Hui-qi1，WANG De-fu1，LIU Yong2，NIU Yan-bing1*

（1CollegeofLifeSciences，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，Shanxi，China；2PlantProtectionInstitute，HunanAcademyofAgriculturalScience，Changsha410125，Hunan，China）

To identify the virus pathogen inducing tomato（Solanum lycopersicumL.）mosaic and curl disease at Jinzhong City of Shanxi Province，the technology of double-stranded RNA（dsRNA）and sequenceindependent amplification（SIA）were used．Results of SIA and sequencing showed that there wasTobacco mosaic virus（TMV）in affected tomato leaves．Further cloning the whole genome sequence of TMV（TMVSXFQ），the TMV-SXFQ was gained（GenBank No. JX993906），which was 6 394 bp in length and presented a typicalTobamovirusgenome organization with 4 ORFs．Sequence comparative analysis showed that the homology of TMV-SXFQ andTobacco mosaic virusand other isolates was 86.3%-99.6%．Phylogenetic analysis suggested that TMV-SXFQ isolates had closeer ties consanguinity with IM strain from South Korea and these 2 isolates formed an independent branch．

Tomato；Pathogen identification；Tobacco mosaic virus（TMV）；Sequence analysis

庞小静，女，硕士研究生，专业方向：分子植物病毒学，E-mail：18235412750@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：牛颜冰，女，教授，硕士生导师，专业方向：分子植物病毒学和中药GAP，E-mail：niuyanbingbest@163.com

2017-02-10；接受日期：2017-04-22

公益性行业（农业）科研专项（201303028），国家自然科学基金项目（31540050）