玉竹初代培养最适条件的筛选

霍妍++赵春莉

摘要：以玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]的叶片、茎段以及根茎作为外殖体，采用不同灭菌方式进行灭菌，在不同基本培养基上进行培养，添加不同种类生长调节剂，分析其最适的初代培养条件。结果表明，最适灭菌方法为75%乙醇处理10 s配合0.1%升汞处理7 min，其污染率为13.3%。根茎作为外殖体有较高的诱导率，达到90.0%；在培养中，最适宜初代培养的基本培养基为MS，其诱导率为86.7%；最适宜根茎分化的生长调节剂为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，其次为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，其分化率分别为80%和62%。

关键词：玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]；初代培养；根茎；组织培养

中图分类号：R282；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）09-1763-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.09.041

Screening of Optimum Conditions of Polygonayum odorayum （Mill.） Druce Primary Culture

HUO Yan，ZHAO Chun-li

（College of Horticulture，Jilin Agriculture University，Changchun 130118， China）

Abstract：Using Polygonatum odoratum（Mill.） Druce leaves，stem and rhizome as explants， and the explants were sterilized with different sterilization，incubated with different basic medium，in different types of additional hormone to investigate the optimum primary culture conditions. The results showed that the optimum method of sterilizing time and 0.1% corrosive sublimate 7 min with 75% alcohol 10 s，the pollution rate was 13.3%. Rhizome as explants had high induction rate，the induction rate was 90.0%. In culture，the most appropriate primary culture of basal medium was MS， the induction rate was 86.7%. Optimum hormone rhizome differentiation of 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，followed by 1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，differentiation rate of 80% and 62%.

Key words： Polygonatum odoratum （Mill.） Druce； primary culture； rhizome； tissue culture

玉竹[Polygonatum odoratum （Mill.） Druce]為百合科多年生草本植物，别名尾参、玉参、铃铛菜、甜根草[1]。玉竹性微寒、味甘，具有润燥养阴、生津止渴的功效，治疗口渴咽干、肺胃阴伤、内热消渴的疗效[2]。玉竹的药用价值十分丰富，其提纯物能增强身体的免疫力，煎剂服用具有扩张血管、抗衰老、抗心肌缺血、抗肿瘤等作用。玉竹可以药食两用，园林中宜植于林下、林缘及建筑物遮阴处作为观赏地被植物，也可盆栽观赏[3-8]。因此，寻找玉竹快速的繁殖途径非常重要。

宁慧等[9]在玉竹组织培养与快速繁殖的研究中发现，其根状茎可作为愈伤组织诱导的外殖体，尤其具有潜伏芽的根状茎有利于玉竹愈伤组织的诱导。宋艳梅[10]等用花蕾和根茎作为外殖体研究发现，在玉竹愈伤组织的诱导中，6-BA、NAA、2，4-D均有利于愈伤组织的诱导和不定芽的分化。本研究以玉竹叶片、茎段及根茎作为外殖体，采用不同灭菌方式进行灭菌，不同的基本培养基进行培养，添加不同种类的生长调节剂，以探讨其最适的初代培养条件，为玉竹的组织培养提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为玉竹，为野外采集的完整植株，采集后保存于吉林农业大学花卉温室内。选取无病虫害、无机械损伤、生长健壮的玉竹植株作为供试材料。

1.2 方法

1.2.1 外殖体的消毒与灭菌方法筛选 灭菌方法：将处理过的外殖体用流水冲洗表面浮土，洗洁精清洗，流水冲洗3 h，用去离子水清洗干净后，放入超净工作台上的无菌烧杯中，75%乙醇浸泡，无菌水冲洗5～6次，再用0.1%升汞消毒，无菌水冲洗5～6次，每次停留3 min，期间不断振荡。

灭菌时间：外殖体灭菌时间的长短在诱导愈伤组织时起重要作用。灭菌时间过长，容易使外殖体发生药害甚至导致死亡；时间过短，灭菌不彻底，会导致污染。为了得到良好的灭菌效果，寻找较适宜的灭菌时间，设置外殖体的灭菌时间处理如表1所示。在无菌条件下，将处理好的外殖体根茎接种于MS培养基上。每个处理10个外殖体，3次重复。30 d后计算污染数和污染率。

1.2.2 最适外殖体的筛选 选择玉竹的根茎、茎段以及叶片作为外殖体，灭菌后，用滤纸吸干表面水分，切去受损不健康的组织，接种到MS培养基中，每个处理10个外殖体，3次重复。所有处理温度与光照相同，培养30 d后观察并记录其成活数与成活率。

1.2.3 最适基本培养基的筛选 取玉竹的最适外殖体，在无菌条件下接种到培养基上，接种的培养基分别为MS、1/2MS、1/4MS、WPM培养基。每个处理10个外殖体，3次重复。接种30 d后记录其死亡数、诱导数以及诱导率。

1.2.4 不同生长调节剂的筛选 取玉竹的最适外殖体，在無菌条件下接种到培养基上，诱导培养基选择MS为基本培养基，配合6-BA、IBA、IAA、NAA、2，4-D 5种生长调节剂组合，其浓度梯度如表2所示，每个处理10个外殖体，5次重复。接种30 d后统计不定芽的分化芽数、分化率以及生长情况。

1.2.5 培养条件 在培养过程中，培养基中加入蔗糖30 g/L，琼脂12～13 g/L， pH 5.5～6.0，培养温 度（23±2） ℃，光照时间24 h/d，光照度30～40 μmsl/（m2·s），光源为日光灯。

1.3 试验数据分析

污染率=（污染的植株数/接种数）×100%。

分化率=（分化芽外殖体数/接种数）×100%。

诱导率=（诱导芽外殖体数/接种数）×100%。

成活率=（外植体成活数/接种数）×100%。

2 结果与分析

2.1 外殖体的消毒与灭菌方法的筛选

将清洗过的玉竹外殖体按照不同方法进行消毒灭菌。由表3可知，培养30 d后，处理A1、A4、A8、A12、A15全部污染死亡，其中处理A1、A8、A4、A12可能由于消毒时间不够，灭菌不彻底，最终导致外殖体全部污染死亡；而处理A15可能由于消毒灭菌时间过长，最终导致外殖体死亡。处理A7的污染率最低，污染数量最少，成活的外殖体数量较多，效果最好。

2.2 最适外殖体的筛选

将玉竹的外殖体（茎段、叶片、根茎）接种在MS培养基中，用表1中处理A7的方法进行消毒灭菌。其中茎段切成1 cm左右的小段，并保留腋芽，切取大部分叶片，保留少部分进行光合作用，切斜茎段并插入培养基中；叶片切成1 cm左右的方形，并用刀片将叶片垂直叶脉方向切割，注意不要切断叶片边缘，将叶背接触培养基，平铺在培养基中进行培养；根茎培养时，用剪刀减去根茎上的须根，切成0.5 cm左右的小段，切面接触培养基进行培养。由表4可知，培养30 d后，根茎的成活率较高，其成活率达到了90.0%，并且生长情况良好，茎段与叶片的成活率较低，分别为43.3%和33.3%，并且污染死亡数较多，未污染的外殖体生长较慢或不生长（图1）。

2.3 最适基本培养基的筛选

取玉竹根茎，75%乙醇处理10 s，无菌水冲洗5～6次，0.1%升汞处理7 min，无菌水冲洗5～6次，分别在MS、1/2MS、1/4MS、WPM培养基中培养。由表5可知，培养30 d后，MS培养基中玉竹根茎外殖体的死亡数量最少，诱导率最高为86.7%，其次为1/2MS培养基的死亡数量较少，其诱导率为73.3%，诱导率相对较低的为1/4MS与WPM培养基，其诱导率分别为56.7%和60.0%（图2）。

2.4 不同生长调节剂的筛选

选取根茎作为外殖体，采用处理A7的方法进行消毒灭菌，MS作为基本培养基，添加不同不同生长调节剂进行培养。由表6可知，培养30 d后，处理B4（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA）与对照B1（MS+1.0 mg/L 6-BA）相比，其分化率最高，达到了80%，培养期间生长速度较快，植株健壮，污染数量与死亡数量较少；其次为处理B3（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA）的分化数量较高，达到62%；处理B2与处理B5的差异不大，且分化率相对较低，但在培养中处理B5的根茎外殖体产生了须根，不利于玉竹外殖体不定芽的产生，不利于增值培养，适宜玉竹根茎外殖体初代培养的培养基为处理B4（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA）（图3）。

3 小结与讨论

在相同条件下，外殖体的灭菌采用75%乙醇处理10 s配合0.1%升汞处理7 min，与其他处理相比，该处理下的外殖体消毒灭菌效果最好，且生长较健壮。在组织培养中，取植株的不同部位作为外殖体，其培养的效果也不同。本试验选取玉竹的根茎、茎段以及叶片作为外殖体，在相同条件下培养根茎的成活率最高，在玉竹的初代培养中，根茎是作为其初代培养最适宜的外殖体，这与宁慧等[9]的研究结果相符。

在初代培养中，基本培养基的种类起重要作用。本试验利用最有效的灭菌效果，用玉竹的根茎作为初代培养外殖体，在MS、1/2MS、1/4MS以及WPM培养基中培养。试验结果表明，MS培养基最适宜作为玉竹初代培养的基本培养基。在玉竹的初代培养中，外殖体需要足够的大量元素、微量元素以及其他营养物质，其他处理培养基中的不能提供其生长所需要的养分。

本试验中MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养基中根茎外殖体的生长效果最好，生长较快且植株健壮，污染和死亡数量较小，其根茎外殖体分化率达到80%，其次为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA培养基，其分化率为62%；但在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D培养基中，虽然根茎外殖体的生长效果较好，但不如MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA与MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA培养基中的外殖体生长效果好，并且培养基中有少量须根产生，不利于玉竹外殖体增殖。由此说明，在玉竹的初代培养中，激素6-BA、NAA以及IAA均有利于玉竹外殖体的生长，这与宋艳梅等[10]的研究结果相符，但与宁慧等[9]的2，4-D有利于不定芽诱导的研究结果不符，可能是由于激素的浓度配比有关，也可能与外殖体采集的时间、地点和季节等有关。

综上所述，在玉竹的初代培养中，利用75%乙醇处理10 s配合0.1%升汞处理10 min进行消毒灭菌，用根茎作为外殖体，MS作为基本培养基并添加1.0 mg/L 6-BA与0.5 mg/L NAA，可有利于玉竹初代培养中不定芽的诱导，这为下一步玉竹组织培养的研究提供依据。

参考文献：

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