基于核磁共振氢谱的膝关节骨性关节炎 肝肾亏虚证血清代谢组学研究

邵勤+周小莉+张莹+吴斌+王莎莎

摘要：目的 研究膝关节骨性关节炎（KOA）肝肾亏虚证的内源性代谢物，探讨KOA肝肾亏虚证辨证的物质代谢轮廓。方法 选取KOA肝肾亏虚证和非肝肾亏虚证患者各50例及20例健康志愿者，空腹8 h后收集血清5 mL，采集核磁共振氢谱（1H-NMR），采用主成分分析法和偏最小二乘法判别分析的模式识别分析法进行多元统计分析。结果 1H-NMR能识别的代谢物23种，KOA患者与健康志愿者比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。KOA肝肾亏虚证患者软骨基质代谢、能量代谢、脂类代谢、疼痛及炎症相关的代谢物与非肝肾亏虚证组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 KOA肝肾亏虚证患者有独特的1H-NMR代谢轮廓，KOA辨证分型具有代谢物质基础。

关键词：代谢组学；核磁共振氢谱；膝关节骨性关节炎；肝肾亏虚

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.007

中图分类号：R274.94 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0027-05

Abstract： Objective To study the endogenous metabolites of liver-kidney deficiency syndrome in knee-joint osteoarthritis （KOA） and explore the metabolic profile of KOA liver-kidney deficiency syndrome. Methods Totally 50 cases of KOA with liver-kidney deficiency syndrome and 50 cases of KOA with non-liver-kidney deficiency syndrome were collected respectively， and 20 cases of healthy volunteers were collected as the normal group. The serum samples of subjects were collected after fasting for 8 h. Hydro-Nuclear Magnetic Resonance （1H-NMR） spectrometer was collected. Principal component analysis and partial least squares discrimination analysis were used to conduct multivariate statistical analysis. Results 1H-NMR could identify 23 kinds of metabolites， and there was statistical significance between KOA patients and healthy volunteers （P<0.05， P<0.01）. There was statistical significance in cartilage matrix metabolism， energy metabolism， lipid metabolism， pain， inflammation-related metabolites in patients with KOA liver-kidney deficiency syndrome and patients with KOA non-liver-kidney deficiency syndrome （P<0.05）. Conclusion Patients with KOA liver-kidney deficiency syndrome have a unique 1H-NMR metabolic profile， KOA syndrome has a metabolic material basis.

Key words： metabolomics； 1H-NMR； knee-joint osteoarthritis； liver-kidney deficiency

膝关节骨性关节炎（knee-joint osteoarthritis，KOA）是一种以进行性膝关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的中老年人的常見病和多发病，是引起膝关节疼痛甚至病残的常见原因，严重影响患者的生活质量和自理能力[1]。KOA属中医学“痹证”“骨痹”

等范畴，中医治疗KOA疗效显著[2-3]。“证”是中医辨证论治的起点和核心，但其理论的科学性一直缺乏有力的直接证据，这也是长期阻碍中医学发展的难题[4]。近年来，基于核磁共振氢谱（1H-NMR）的代谢组学检测方法为中医证候客观化研究提供了新的思路和手段[5]。本研究采用1H-NMR代谢组学检测技术分析KOA肝肾亏虚证患者血清的代谢组学变化，寻找KOA肝肾亏虚证的代谢轮廓，为其“证”的本质研究提供物质基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2014年1月-2016年3月KOA患者。肝肾亏虚证患者50例，其中男16例，女34例；年龄55～75岁，平均年龄（62.8±6.9）岁；病程最短3个月，最长20年，平均病程（3.9±3.1）年。非肝肾亏虚证患者50例，其中男15例，女35例；年龄55～75岁，平均年龄（62.7±8.6）岁；病程最短1个月，最长11年，平均病程（3.5±2.9）年。正常组选取本院门诊体检的健康志愿者20例，其中男7例，女13例，平均年龄（61.9±4.1）岁。3组性别、年龄、体质指数（BMI）比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性；非肝肾亏虚证组、肝肾亏虚证组病程、西安大略-麦克马斯特（WOMAC）[6]评分比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。本研究经本院伦理委员会批准。endprint

1.2 西医诊断标准

采用2010年《骨关节炎诊断及治疗指南》[7]KOA标准。患者符合分类标准（1）（2）均可。

（1）临床标准：①近1个月大多数时间有膝关节疼痛；②有骨摩擦音；③晨僵时间≤30 min；④年龄≥38岁；⑤有骨性膨大。满足①②③④或①②⑤或①④⑤即可诊断。

（2）临床+放射学+实验室标准：①近1个月大多数时间有膝关节疼痛；②X线示骨赘形成；③关节液检查符合骨性关节炎（OA）；④年龄≥40岁；⑤晨僵≤30 min；⑥有骨摩擦音。滿足①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可诊断。

1.3 中医辨证标准

采用《中药新药临床研究指导原则（试行）》[8]及《中医内科常见疾病诊疗指南》[9]中肝肾亏虚证辨证标准。主症：关节疼痛，腰膝酸软，痿弱乏力。次症：骨节肥大，活动不利，运动牵强。舌质淡红，苔薄白，脉滑或弦。

1.4 纳入标准

①年龄55～75岁；②患者符合上述西医诊断标准；③肝肾亏虚证组符合肝肾亏虚证辨证标准；④近4周未使用糖皮质激素及近2周内未用其他方法治疗；⑤所有受试者均签署知情同意书。

1.5 排除标准

①患有影响关节的疾病，如类风湿关节炎、银屑病、代谢性骨病及急性创伤等；②合并心脑血管、肝、肾、造血系统及内分泌系统等严重原发性疾病；③精神病患者。

2 方法

2.1 血清样本收集与处理

患者及健康志愿者均空腹8 h，8：00-10：00空腹静息状态下采集静脉血5 mL。3000 r/min离心10 min，收集血清于EP冻存管中，-80 ℃冰箱保存，备用。

2.2 检测样本制备

在1H-NMR检测前，-80 ℃冰箱取出血清，梯度解冻。取300 ?L 血清置离心管中，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（0.2 moL/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.4）200 ?L，4 ℃、14 000×g离心10 min，取上清液，置于5 mm核磁管中，再加入100 ?L氘代重水，震荡混匀，4 ℃冰箱保存备用。

2.3 核磁共振氢谱数据采集与处理

使用Bruker UltraShield?500 MHz核磁共振波谱仪，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill自旋回波序列结合预饱和方法采集信号。自由感应衰减（FID）采样点为32 k，采集累加次数128，控制温度在298 K。信号经过32 k傅立叶变换转为NMR图谱。将图谱文件夹导入MestReNova 10.0分析软件进行分析、积分，积分区间为δ 0.5～9.0，积分间隔0.004 ppm，为消除剩余水峰引起的影响，将δ 4.6～5.1区域设为零积分分段。对所产生的积分数据进行归一化处理。

2.4 模式识别分析

将数据导入SIMCA-P12.0软件进行多元统计分析，进行主成分分析（PCA）。为消除相关因素（如个体差异）对分组的影响，强化组间差异，进一步采用正交信号校正处理，再行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的模式识别分析。分析结果以得分图表示，直观给出各样本分布。

2.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以 —x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料组间比较采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 3组血清代谢物核磁共振氢谱图谱

根据文献[10]和人类代谢组数据库信息（HMDB），结合二维谱图对1H-NMR图中进行检测的血清代谢物的核磁共振信号归属，能识别的代谢物共23种，见图1。

3.2 3组血清代谢物主成分分析和偏最小二乘法判别分析

对各组血清代谢谱的数据进行PCA和PLS-DA，见图2。PCA积分图（a）成分积分值主要集中分布于散点图（95%置信区间）的3个区域，正常组和肝肾亏虚证组分布集中，非肝肾亏虚证组分布较为分散。PLS-DA积分图（b）3组样本在t[1]维能较好地分开，说明组间差异显著。

为了进一步说明各组代谢物的区别，找出分组贡献较大的代谢物，将PCA和PLS-DA结果得到的代谢物经内标校正的峰值面积归一化进行统计学分析，KOA患者软骨基质降解相关的代谢物缬氨酸、羟脯氨酸、N-乙酰基半乳糖胺、甘氨酸、组氨酸与正常组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），肝肾亏虚证组低于非肝肾亏虚证组（P<0.05）；KOA患者能量相关的代谢物α-葡萄糖、β-葡萄糖、肌酸低于正常组（P<0.05，P<0.01），肝肾亏虚证组葡萄糖水平明显低于非肝肾亏虚组（P<0.05），乳酸水平低于非肝肾亏虚证组（P<0.05），肌酸、丙酮酸明显高于非肝肾亏虚证组（P<0.05）；KOA患者脂类代谢相关的代谢物脂质、脂肪酸水平高于正常组（P<0.05，P<0.01），肝肾亏虚证组脂质、脂肪酸水平低于非肝肾亏虚证组（P<0.05）；KOA患者疼痛、炎症相关代谢物乳酸、丙氨酸、丙酮酸较正常组显著升高（P<0.05，P<0.01），肝肾亏虚证组的γ-氨基丁酸、组氨酸水平低于非肝肾亏虚证组（P<0.05），L-色氨酸水平高于非肝肾亏虚证组（P<0.05）。结果见表2。

4 讨论

“证”是对疾病发展过程中某一阶段的病机概括，具有整体性和动态性。代谢组学从微观入手，系统研究机体在新陈代谢动态进程中所有代谢物的变化规律，二者的思路和研究方法具有趋同性。从系统生物学角度看，疾病是因蛋白质网络和基因调节网络异常而致，而中医的“证候”可能是由于这种异常所引发的一种特异性变化状态，表现为体液中内源性成分的变化，这一改变可以组、群、谱的特征出现[11]。本研究发现，3组血清样本1H-NMR检测的代谢图谱差异有统计学意义。endprint

4.1 与软骨基质降解相关的代谢物变化

与软骨基质胶原和蛋白聚糖相关的代谢产物产生的氨基酸类物质是患者体内能检测到的最大代谢物群，而且在OA的不同病理阶段呈动态变化[12]。本研究发现，KOA患者与基质降解相关的甘氨酸和组氨酸较正常组高，而与基质合成相关氨基酸（缬氨酸、羟脯氨酸等）减少。原因可能是本研究中KOA患者以早中期为主，此病理阶段的软骨基质以降解为主，伴有基质合成不足。N-乙酰基半乳糖胺是硫酸软骨素相关的代谢产物，而硫酸软骨素是关节软骨基质蛋白聚糖的重要成分之一，既往研究表明，N-乙酰基半乳糖胺可作為OA疾病进展的一个重要的生物标志物[13]。肝肾亏虚证患者血清中甘氨酸、组氨酸、缬氨酸、羟脯氨酸、N-乙酰基半乳糖胺含量均低于非肝肾亏虚证患者，可能肝肾亏虚证患者处于KOA慢性期，病程较长，软骨基质的合成和降解低于非肝肾亏虚证患者。

4.2 与能量代谢相关的代谢物变化

OA病变过程中，机体启动自身调控机制代偿性维持相关的修饰蛋白和胶原蛋白的形成，这些生化过程中需要额外能量，KOA患者α-葡萄糖、β-葡萄糖较正常人低[14]。本研究也发现KOA患者伴有α-葡萄糖、β-葡萄糖降低。肌酸在细胞能量代谢中起着举足轻重的作用，其作为“ATP运输机”携带ATP到被利用的位点。退化的软骨中低浓度的肌酸可能会干扰细胞能量代谢[15]。

在病理状态下，由于机械压力、氧化应激等原因，关节组织中葡萄糖分解生成丙酮酸超过了三羧酸循环的氧化能力，剩余的丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下形成乳酸，导致组织中乳酸产生增加、积累，进一步导致细胞凋亡或死亡。同时，也可导致关节在酸性环境下细胞基质合成下降，基质降解增加，进一步加重软骨退变[16]。本研究发现，患者血清中乳酸、丙氨酸、丙酮酸显著高于正常组，提示KOA关节内环境存在缺氧和酸中毒等内环境紊乱状态，这也是患者出现关节肌肉酸软疼痛的原因之一。

肝肾亏虚证组葡萄糖、乳酸水平明显低于非肝肾亏虚证组，而肌酸、丙酮酸明显高于非肝肾亏虚证组，提示肝肾亏虚证患者能量代谢紊乱程度高，处于相对能量不足状态，可导致气血运行不畅，“不通则痛”。这与肝肾亏虚证患者常伴有腰膝酸软乏力等有关。

4.3 与脂类代谢相关的代谢物变化

目前研究发现，OA不是单一与衰老和生物学应力相关的疾病，也与代谢紊乱多种因素相关，脂肪代谢参与疾病的起始和进展，在OA软骨细胞中有大量脂肪沉积[17]。本研究发现，在KOA患者血清中，其脂质含量明显高于正常组，其水解产物脂肪酸增加。脂肪酸在线粒体中β氧化生成的大量乙酰辅酶A，除氧化磷酸化提供能量外，也可合成酮体，包括乙酰乙酸、β-羟丁酸、丙酮。本研究中，KOA患者血清中丙酮含量高于正常组。肥胖是OA发病的危险因素，可加重关节局部机械应力，同时也与脂类代谢异常密切相关。肝肾亏虚证患者脂质、脂肪酸水平低于非肝肾亏虚证患者，考虑与非肝肾亏虚证患者痰浊瘀滞证型与脂质代谢异常更密切相关。

4.4 与疼痛、炎症相关的代谢物变化

既往研究发现，在KOA患者的大脑前扣带皮质发现γ-氨基丁酸异常增多，提示其可作为KOA产生慢性关节疼痛潜在的代谢标志物[18]。本研究发现，KOA患者的γ-氨基丁酸显著高于正常组。同时，KOA患者血清中的乳酸、丙氨酸、丙酮酸明显升高，这也是患者出现关节肌肉酸软疼痛的原因之一。L-色氨酸在人类各种慢性炎症性疾病中扮演重要角色，与OA关节慢性炎症的微环境相关[19]。在OA患者中，在组氨酸脱羟酶的催化下，组氨酸促进组织胺的合成，加剧关节软骨的破坏和关节炎症反应。KOA炎症相关代谢物的改变，也表明OA不仅是一种“磨损和撕裂”病变，同时也是慢性炎症病变[20]。肝肾亏虚证患者的γ-氨基丁酸、组氨酸水平低于非肝肾亏虚证患者，而L-色氨酸水平高于非肝肾亏虚证患者，这也可能是肝肾亏虚证患者急性疼痛及急性炎症较非肝肾亏虚证患者少，常呈慢性疼痛和慢性炎症临床表现的原因。

本结果表明，KOA肝肾亏虚证与非肝肾亏虚证的血清样本中有多种代谢物含量存在明显差异，利用PCA和PLS-DA模式识别分析法可将患者进行较理想的区分，提示KOA辨证分型具有客观存在的物质基础。这些内源性代谢物与证候的相关性及其在证候发生机制中的作用有待于进一步研究。

致谢：重庆大学化工学院熊燕教授对本研究予以大力支持和悉心指导，在此表示感谢！

参考文献：

[1] LITWIC A， EDWARDS M H， DENNISON E M， et al. Epidemiology and burden of osteoarthritis[J]. Br Med Bull，2013，105：185-199.

[2] 周小莉，张莹，邵勤，等.基于关节超声评价独活寄生汤治疗肝肾亏虚型膝关节骨性关节炎临床疗效[J].中国中医药信息杂志，2015，22（1）：18-21.

[3] 任伟亮，朱艳风，韩昆，等.骨氏葆方治疗肾虚血瘀型膝重度骨关节炎的临床研究[J].南京中医药大学学报，2016，32（2）：118-121.

[4] 张静，刘龙，颜新，等.中医证本质研究与代谢组学技术：现状与思考[J].中西医结合学报，2012，10（10）：1069-1076.

[5] 韩淳淳，周红光，陈海彬，等.代谢组学在中医基础理论研究中的应用[J].中国中医药信息杂志，2013，22（1）：18-21.

[6] POLLARD B， JOHNSTON M， DIXON D. Exploring differential item functioning in the Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index （WOMAC）[J]. BMC Musculoskelet Disord，2012， 13：1471-1474.endprint

[7] 中华医学会风湿病学分会.骨关节炎诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志，2010，14（6）：416-419.

[8] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则（试行）[M].北京：中国医药科技出版社，2002：349-353.

[9] 中华中医药学会.中医内科常见疾病诊疗指南[M].北京：中国中医药出版社，2008：129-131.

[10] JEREMY K， NLCHOLSON， PETA J D， et al. 750 MHz 1H and 1H-l3C NMR spectroscopy of human blood plasma[J]. Anal Chem，1996，67：793- 811.

[11] 杨松滨，李昕，苏明明，等.膝骨关节炎患者尿液代谢产物谱及与证候相关性研究[J].上海中医药大学学报，2009，32（1）：33-37.

[12] ZIGNEGO D L， HILMER J K， JUNE R K. Mechanotransduction in primary human osteoarthritic chondrocytes is mediated by metabolism of energy， lipids， and amino acids[J]. J Biomech，2015， 48（16）：4253-4261.

[13] MALEMUD C J. Biologic basis of osteoarthritis：state of the evidence[J]. Curr Opin Rheumatol，2015，27（3）：289-294.

[14] PACHOLCZYK-SIENICKA B， RADEK M， RADEK A， et al. Characterization of metabolites determined by means of 1H HR MAS NMR in intervertebral disc degeneration[J]. MAGMA，2015，28（2）：173-183.

[15] NEVES M J， GUALANO B， ROSCHEL H， et al. Beneficial effect of creatine supplementation in knee osteoarthritis[J]. Med Sci Sports Exerc，2011，43（8）：1538-1543.

[16] STOGOV M V， OVCHINNIKOV E N， SAZONOVA N V. Metabolic status of patients of different age groups on the stahes of osteoarthritis[J]. Adv Gerontol，2015，28（1）：86-90.

[17] KOSINSKA M K， MASTBERGEN S C， LIEBISCH G， et al. Comparative lipidomic analysis of synovial fluid in human and canine osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage，2016，24（8）：1470- 1478.

[18] KANG K Y， LEE S H， JUNG S M， et al. Downregulation of tryptophan-related metabolomic profile in rheumatoid arthritis synovial fluid[J]. J Rheumatol，2015，42（11）：2003-2011.

[19] YAMAURA K， AKIYAMA S， UENO K. Increased expression of the histamine H4 receptor subtype in hypertrophic differentiation of chondrogenic ATDC5 cells[J]. J Cell Biochem，2012，113（3）：1054- 1060.

[20] BERENBAUM F. Osteoarthritis as an inflammatory disease （osteoarthritis is not osteoarthrosis！）[J]. Osteoarthritis Cartilage，2013，21（1）：16-21.

（收稿日期：2016-11-27）

（修回日期：2017-01-25；編辑：季巍巍）endprint