六氧化四砷对乳腺癌MCF—7细胞增殖、迁移 及侵袭能力的影响

刘秋雨+裴日周+钱林林+连增林

摘要：目的 观察六氧化四砷（As4O6）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，探讨其作用机制。方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，不同浓度As4O6对细胞进行干预。MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，划痕愈合实验检测细胞迁移能力，半定量RT-PCR检测细胞周期蛋白E1（Cyclin E1）、细胞周期蛋白A2（Cyclin A2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、p21和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表达情况。结果 As4O6对MCF-7细胞增殖有明显抑制作用，且呈剂量依赖性（P<0.01）；与对照组（0 μmol/L）比较，As4O6浓度为9、12、15 μmol/L时，MCF-7细胞凋亡率明显增加（P<0.05，P<0.01）；As4O6高（3 μmol/L）、低（1 μmol/L）浓度均可有效抑制MCF-7细胞的迁移能力（P<0.01）；随As4O6浓度增加，Cyclin E1、Caspase-3、p21 mRNA表达明显升高，Cyclin A2、MMP-9 mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论 As4O6对乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期、侵袭及迁移能力有明显抑制作用，其机制可能与增强Cyclin E1、Caspase-3、p21及抑制Cyclin A2、MMP-9 mRNA表达有关。

关键词：六氧化四砷；乳腺癌细胞；细胞凋亡；细胞增殖；侵袭；迁移；细胞周期

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of tetra-atsenic oxide （As4O6） on the proliferation， migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells； To explore its potential mechanism. Methods The human breast cancer MCF-7 cells were regarded as the research object and cultured in vitro， with different concentrations of As4O6 using to intervene in MCF-7 cells. The cell proliferation was detected by MTT assay； the flow cytometry and wound-healing assay were used to detect the cell apoptosis and migration， respectively. The expressions of Cyclin E1， Cyclin A2， Caspase 3， p21 and MMP-9 mRNA were accessed by semi quantitative RT-PCR. Results As4O6 had a significant inhibitory effect on the proliferation of MCF-7 cells in a dose dependent manner. Compared with the control group （0 μmol/L）， the apoptosis rate increased significantly when the concentration of As4O6 was 9， 12， 15 μmol/L （P<0.01）. Either As4O6 at high （3 μmol/L） or low （1 μmol/L） concentration could effectively inhibit the migration of MCF-7 cells （P<0.01）. With the increasing concentration of As4O6， the expressions of Cyclin E1， Caspase 3， and p21 mRNA significantly increased， while the expressions of Cyclin A2 and MMP-9 mRNA significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion As4O6 can significantly inhibit the proliferation， cycle， invasion and migration of breast cancer MCF-7 cells， and the mechanism may be related to the increase of expressions of cyclin E1， caspase 3， p21 and inhibition of expressions of cyclin A2 and MMP-9.

Key words： tetra-arsenic oxide； breast cancer cells； cell apoptosis； cell proliferation； invasion； migration； cell cycle

砷劑是古老的抗肿瘤药物，以常见的氧化剂和硫化剂等形式存在。《本草纲目》载：“砒石又名信石、砒霜，可治烂肉、蚀瘀及腐瘰。”虽然砷剂被沿用至今，但其毒性限制了其适用范围。三氧化二砷（As2O3）是最广为熟知的砷剂，临床用于急性早幼粒细胞白血病及多种肿瘤的治疗。六氧化四砷（As4O6）对子宫颈癌细胞[1]、人胃癌细胞[2]、上皮癌细胞[3]等均有一定抑制作用，但其对乳腺癌的干预研究鲜有报道。因此，本研究观察不同浓度As4O6对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、周期和侵袭、迁移能力的影响，为As4O6干预乳腺癌的分子作用机制提供依据。endprint

1 实验材料

1.1 细胞

人乳腺癌MCF-7细胞株，中国科学院上海细胞库。

1.2 药物及制备

As4O6，纯度99.99%，韩国Chonjisan Co.， Ltd.公司。称取一定量As4O6溶解于水中，配制成5 mmol/L母液，过滤，室温保存备用，临用时以培养基稀释至不同浓度。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、MEM培养液，Hyclone公司。MTT（Amresco）、二甲基亚砜（DMSO，Amresco）、青链霉素混合液（Solarbio）、RT-PCR试剂盒和Trizol，日本TaKaRa公司。Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计合成。FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰），MCO-175 CO2培养箱（日本SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），MULTLSKAN MK3酶标仪（美国Thermo公司），BIOMATE型紫外可见分光光度计（美国Thermo公司），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），Champ Gel 5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 MTT法检测MCF-7细胞增殖

取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞株，0.25%胰酶消化后，用含10%FBS MEM培养液稀释成2.5×104个/mL细胞悬液，以200 μL/孔接种于96孔培养板，37 ℃、5%CO2培养箱中预培养24 h。分别设置空白孔、调零孔和As4O6给药孔。As4O6给药浓度分别为4、8、16、32、64 μmol/L，200 μL/孔，每组设6个复孔，继续培养24 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，于培养箱内孵育4 h，弃去培养液，每孔加100 μL DMSO，室温振荡15 min。待沉淀完全溶解后，于酶标仪570 nm处测定光密度（OD）。计算细胞存活率（实验组OD值÷对照组OD值×100%）。

2.2 流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡

取对数生长期细胞，以1×105个/mL密度接种于培养瓶中，24 h后加入含10%FBS MEM培养液稀释的各浓度As4O6溶液（0、1、3、6、9、12、15 μmol/L）继续培养24 h，收集所有细胞，严格按照Annexin V-FITC试剂盒说明书进行操作，流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡。

2.3 划痕愈合实验检测MCF-7细胞迁移、侵袭能力

收集对数生长期MCF-7细胞，以2.5×105个/mL密度接种于6孔板中，2 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。培养至细胞长满培养板后，吸弃上清液，用10 μL吸头在6孔板上划“一”字，PBS轻轻冲洗2次。每孔分别加入不含FBS MEM培养液稀释的各浓度As4O6溶液（0、1、3 μmol/L），各设3个复孔，100倍倒置显微镜下，分别于药物作用0、24、48 h拍照。计算划痕愈合率[（0 h划痕面积-24/48 h划痕面积）÷0 h划痕面积×100%]。

2.4 RT-PCR检测细胞周期、凋亡及迁移相关基因的表达

采用Trizol两步法提取MCF-7细胞内的总RNA，测定OD260/OD280值。按TaKaRa RT-PCR试剂盒说明合成cDNA第一链，以此cDNA为模板进行PCR反应。PCR退火温度及循环数：β-actin为58 ℃、30循环，p21为60.5 ℃、40循环，细胞周期蛋白E1（Cyclin E1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）为58 ℃、30循环，细胞周期蛋白A2（Cyclin A2）为57.7 ℃、40循环，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）为60.5 ℃、45循环。反应结束后，将PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳。引物序列见表1。

3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

MTT法结果显示，经不同浓度As4O6干預后，MCF-7细胞生长受到明显抑制，差异有统计学意义（P<0.01）。随As4O6浓度增加，MCF-7细胞存活率逐渐降低，呈剂量依赖性，见图1。

4.2 六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

流式细胞术分别检测了不同浓度As4O6对MCF-7细胞的凋亡作用，Annexin V-FITC/PI双参数检测显示，细胞机械损伤程度非常小，细胞因机械损伤的数目很少（<1%）。当As4O6浓度为1、3、6 μmol/L时，细胞凋亡率均<10%，与对照组（0 μmol/L）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，在0～3 μmol/L间选择适当浓度，研究As4O6对MCF-7细胞迁移侵袭作用的影响。随As4O6浓度增加（9、12、15 μmol/L），细胞凋亡率升高，与0 μmol/L比较，细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图2。

4.3 六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞迁移能力的影响

与0 μmol/L比较，低浓度（1 μmol/L）和高浓度（3 μmol/L）As4O6对MCF-7细胞的迁移能力均有明显抑制作用（P<0.01），随As4O6浓度增加，抑制作用明显增强，呈剂量依赖性，见图3。

4.4 六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞凋亡和周期相关基因表达的影响endprint

琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡（Caspase-3、p21）和周期（Cyclin A2、Cyclin E1）相关基因表达情况。结果表明，As4O6作用于MCF-7细胞24 h后，随As4O6给药浓度增加，Cyclin E1、p21 mRNA表达呈升高趋势，Cyclin A2 mRNA表达呈递减趋势，呈剂量依赖性；在As4O6高浓度（15 μmol/L）时，Caspase-3、p21、Cyclin A2、Cyclin E1 mRNA表达水平与0 μmol/L比较，差异均有统计学意义（P<0.01），见图4。

4.5 六氧化四砷对乳腺癌MCF-7细胞基质金属蛋白酶-9基因表达的影响

MMP-9与侵袭转移相关，其mRNA表达随As4O6浓度增加而逐渐降低。高浓度（15 μmol/L）As4O6与0 μmol/L比较，MMP-9 mRNA表达差异有统计学意义（P<0.01），见图5。

5 讨论

研究表明，As4O6可通过引起肿瘤细胞凋亡[4]、抑制肿瘤血管新生[5]、增加实体肿瘤对放射的敏感性[6]等多种方式发挥抗肿瘤药效作用。但其对乳腺癌的作用机制尚不明确，而乳腺癌在全球女性癌症患病率排名居首，迫切需要有效的治疗药物。因此，研究As4O6治疗乳腺癌的作用机制十分必要。

细胞凋亡和周期是衡量肿瘤细胞的重要指标，细胞增殖和细胞凋亡之间的失衡也可导致肿瘤生成。本研究结果表明，As4O6对乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用明显，并随As4O6浓度增加而增强，当浓度达到64 μmol/L时，细胞存活率<50%。当浓度为9、12、15 μmol/L时，作用于MCF-7细胞24 h可明显引起凋亡。Caspase-3和p21是与细胞凋亡关系密切的2种基因，正常情况下细胞质中Caspase-3无活性，以酶原形式存在，当细胞受到凋亡信号刺激时，它被一系列反应激活后诱导细胞凋亡发生[7]。同时，p21基因的过表达可促进细胞凋亡，并可使细胞周期阻滞于G1、G2或S期。而本研究结果表明，随As4O6浓度增加，Caspase-3和p21均呈增加趋势，且流式细胞术检测结果表明，MCF-7细胞凋亡情况与上述特点相符，提示As4O6可通过促进MCF-7细胞凋亡途径达到抑制肿瘤细胞增殖目的。为进一步明确As4O6对MCF-7细胞的作用机制，本研究检测了细胞周期相关基因（Cyclin A2和Cyclin E1）的表达情况。Cyclin A2为一种细胞周期的正向调节蛋白，可与细胞周期依赖性激酶（CDK1和CDK2）形成复合物，在细胞周期G1/S和G2/M转换中发挥调节DNA合成和促进细胞有丝分裂的双重作用，同时，Cyclin E1是G1期重要的调控细胞周期的关键蛋白，促进细胞周期的G1/S移行过程，并且是移行过程中的主要限速因子，一旦Cyclin E1基因扩增或表达失控则可能诱发肿瘤[8-10]。本研究结果表明，As4O6可抑制Cyclin A2基因的表达，经As4O6干预后，MCF-7细胞Cyclin A2表达显著降低，表明As4O6可以通过干预细胞周期达到治疗目的。而Cyclin E1与Cyclin A2的结果相反，As4O6干预后，MCF-7细胞Cyclin E1表达显著升高，这一现象可能与细胞周期阻滞相关。因此，更加明确了As4O6对MCF-7细胞凋亡和周期相关基因的作用机制。

乳腺癌是由乳房组织病变导致的癌症，由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间的黏附能力下降，容易发生脱落，形成的游离癌细胞可随血液或淋巴液散布周身，使乳腺癌发生侵袭转移。MMP-9是肿瘤细胞发生侵袭转移的主要参与者。由于Ⅳ型胶原是构成细胞外基质的基本骨架，而MMP-9分泌的明胶酶可降解Ⅳ型胶原[11]，因此MMP-9在肿瘤的侵袭及转移过程中起到关键作用。本研究结果表明，经As4O6干预后，MCF-7细胞MMP-9 mRNA表达呈降低趋势，提示As4O6可通过抑制MMP-9基因的表达有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。进一步结合划痕愈合实验结果，表明As4O6可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和迁移能力。

综上所述，As4O6可通过干预细胞凋亡、细胞阻滞、细胞侵袭及迁移能力等多途径发挥药效。As4O6可促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡，将其阻滞在S期，破坏肿瘤细胞DNA合成来抑制细胞增殖，其机制可能与p21、Caspase-3、Cyclin E1、Cyclin A2有关。此外，As4O6可通过抑制MMP-9分泌，阻止细胞基底膜降解，达到对MCF-7细胞侵袭转移能力的抑制作用。

參考文献：

[1] KIM Y W， BAE S M， LEE K H， et al. Retraction：comparison of As2O3 and As4O6 in the detection of SiHa cervical cancer cell growth inhibition pathway[J]. Cancer Res Treat，2007，39（1）：47.

[2] CHUNG W H， KOO H J， KUH H J， et al. Anti-proliferative effect of tetra-arsenic oxide （TetraAs） in human gastric cancer cells in vitro[J]. Kor Pharm Sci，2007，37（5）：305-309.

[3] WOO S H， PARK M J， AN S， et al. Diarsenic and tetraarsenic oxide inhibit cell cycle progression and bFGF- and VEGF-induced proliferation of human endothelial cells[J]. J Cell Biochem， 2005，95（1）：120-130.endprint

[4] PARK I C， PARK M J， WOO S H， et al. Tetraarsenic oxide induces apoptosis in U937 leukemic cells through a reactive oxygen species-dependent pathway[J]. Int J Oncol，2003，23（4）：943-948.

[5] PARK M J， PARK I C， BAE I J， et al. Tetraarsenic oxide， a novel orally administrable angiogenesis inhibitor[J]. Int J Oncol， 2003，22（6）：1271-1276.

[6] PARK S G， JUNG J J， WON H J， et al. Tetra-arsenic oxide （Tetras） enhances radiation sensitivity of solid tumors by anti-vascular effect[J]. Cancer Lett，2009，277（2）：212-217.

[7] ZHANG Y， GOODYER C， LEBLANC A. Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjection with active caspase-3，-6，-7 and -8[J]. J Neurosci，2000，20（22）：8384-8389.

[8] LI H P， JI J F， HOU K Y， et al. Prediction of recurrence risk in early breast cancer using human epidermal growth factor 2 and cyclin A2[J]. Chin Med J （Engl），2010，123（4）：431-437.

[9] 吉愛军，唐金海.乳腺癌术后患者Cyclin A1、A2、D1、E1表达及其临床意义[J].南京医科大学学报，2010，30（9）：1290-1294.

[10] 王敏，李惠平，赵红梅，等.Bcl-2、cyclin A2和PI3K在激素受体阴性乳腺癌中的表达及意义[J].中国微创外科杂志，2013，13（8）：713-723.

[11] ARVELO F， COTTE C. Metalloproteinases in tumor progression[J]. Invest Clin，2006，47（2）：185-205.

（收稿日期：2016-12-09）

（修回日期：2016-12-19；编辑：向宇雁）endprint