辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT—29细胞凋亡的影响

尹丽颖+李凤金+仲丽丽+敖鹏+张妍妍+边晓燕+唐丹丽

摘要：目的 探讨辽东楤木叶总皂苷（ETS）诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响。方法 MTT法检测不同浓度（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg）ETS培养的结肠癌HT-29细胞增殖率，Hoechst33258染色和激光共聚焦成像检测细胞凋亡，并观察凋亡细胞的形态学改变，免疫组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果 ETS可诱导HT-29细胞发生凋亡，且凋亡作用在一定范围内呈剂量依赖性；ETS可使HT-29细胞Bcl-2表达降低、Bax表达升高（P<0.05，P<0.01），且呈明显的量效关系。结论 ETS可诱导HT-29细胞凋亡，其凋亡机制可能与降低Bcl-2、升高Bax的表达相关。

关键词：辽东楤木叶总皂苷；HT-29细胞；细胞凋亡；Bcl-2；Bax

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）06-0049-04

Abstract： Objective To study the apoptosis of human colorectal cancer HT-29 cells induced by Aralia elata Seem leaf total saponin （ETS） and its effects on the expression of relevant proteins. Methods MTT assay was used to detect the proliferation of human colorectal cancer HT-29 cells cultivated with different concentrations （6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200 mg/kg） of ETS. Hoechst33258 staining and laser confocal imaging were used to detect the apoptotic cells. Morphological changes were observed. The expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immuno- histochemistry. Results ETS could induce apoptosis of HT-29 cells and apoptosis was in a dose-dependent manner in a certain range. ETS could decrease the expression of Bcl-2 and increase the expression of Bax in HT-29 cells （P<0.05， P<0.01）， showing a significant dose-effect relationship. Conclusion ETS can induce the apoptosis of HT-29 cells， and the mechanism may be related to reducing the expression of Bcl-2 and increasing the expression of Bax.

Key words： Aralia elata Seem leaf total saponin； HT-29 cells； cell apoptosis； Bcl-2； Bax

隨着我国人民生活水平的提高，全民的膳食结构发生了重大改变，结肠癌的发病率和死亡率也随之升高[1]。目前除传统手术、放化疗等手段外，中医药治疗结肠癌越来越受到青睐。本课题组前期研究发现，辽东楤木叶总皂苷（total saponine of Aralia Elata Seem leaves，ETS）具有良好的抗肿瘤作用，且对人结肠癌作用效果明显，但其作用机制尚不十分明确[2]。本实验采用MTT法检测人结肠癌HT-29细胞增殖率，通过Hoechst33258染色、激光共聚焦成像等方法检测细胞凋亡，观察ETS对凋亡细胞形态的影响，并用免疫

组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，探讨ETS对HT-29细胞凋亡的诱导作用及其可能的机制。

1 实验材料

1.1 药物和细胞株

ETS由黑龙江中医药大学药理教研室提供；人结肠癌HT-29细胞株由中国医学科学院基础医学研究所提供。

1.2 主要试剂与仪器

MTT（美国Sigma公司，批号0793）；hyclone PRMI-1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司，批号AAJ206662）；胎牛血清（TBD，批号OW20150122-0256）；Hoechst33258荧光染液（碧云天生物技术研究所，批号20131105）；抗Bcl-2抗体（Sant Cruz，批号14H80415）；抗Bax抗体（Sant Cruz， 批号14V70207）；S-P Kit试剂盒（福州迈新试剂公司，批号SA1052）。激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司），CO2培养箱（HF90/HF240力新仪器上海有限公司），荧光显微镜（德国Leica），电热恒温水浴锅（DK-S24，上海森信实验仪器有限公司），低速离心机（LDZ4-1.2，北京医用离心机厂），MILLI-Q超纯净水纯化系统（北京同德创业科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

常规培养HT-29细胞至80%～90%融合时，PBS冲洗后加入含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶1 mL消化，低速离心。弃上清液，加入新鲜培养基，分装后于5%CO2、37 ℃下培养备用。endprint

2.2 细胞增殖检测

取对数生长期HT-29细胞，调整浓度至1×105/mL，接种于96孔板上，每孔100 μL悬液，每组6个复孔，5%CO2、37 ℃孵育24 h，随后依次加入不同浓度的ETS加药培养基（6.25、12.5、25、50、100、200 mg/kg），对照组加入等体积空白培养基。48 h后弃培养基，加入MTT溶液，5%CO2、37 ℃孵育4 h，加入DMSO溶液，37 ℃溶解10 min，于酶标仪波长570 nm处测定吸光度（OD），计算细胞抑制率[（1-受试药组平均OD值÷对照组平均OD值）×100%]。

2.3 细胞核染色

按“2.1”项方法培养细胞。于6孔板中进行细胞爬片，培养24 h后给药组加入含不同浓度（10、20、40 mg/kg）ETS的1640培养基2 mL，对照组加入等体积1640培养基。培养48 h后，弃培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛0.5 mL固定10 min，PBS冲洗2次，加入Hoechst33258染色液，5 min后PBS冲洗2次，自然晾干，荧光显微镜观察并拍照。

2.4 细胞凋亡检测

按 “2.3”项下方法培养细胞。培养48 h后弃培养液，PBS冲洗2次×2 min，加入200 μL Binding Buffer，再加入10 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，室温避光染色15 min，最后加入300 μL Binding Buffer，激光扫描共聚焦显微镜检测。

2.5 Bcl-2、Bax表达检测

按 “2.3”项下方法培养细胞。培养48 h后弃培养液，PBS冲洗2次×2 min，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗3次×3 min，加入PBS配制新鲜的3%H2O2，室温孵育10 min灭活内源酶后，PBS冲洗3次×3 min，随后加入正常山羊血清封闭液，室温20 min。冲洗后加入抗Bcl-2抗体、抗Bax抗体及抗GAPDH抗体（1∶200稀释），4 ℃过夜，PBS冲洗后加入辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗后DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片、镜检。高清晰图文分析系统对图像进行分析，以核膜或胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性区域，随机选取5个400倍视野计算阳性细胞率。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响

不同浓度ETS对HT-29细胞有不同程度的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性。50、100、200 mg/kg ETS组较对照组差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

4.2 Hoechst33258染色细胞核结果

与对照组细胞核均匀淡蓝色比较，经ETS处理后，HT-29细胞核呈亮蓝色浓染，说明细胞核染色质发生了固缩，致使细胞核与Hoechst33258的结合能力增强，且随浓度的增加，亮蓝染色的比例增加。结果见图1。

4.3 AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡结果

对照组细胞结构完整，呈不规则三角形，无染色或仅有微弱的绿色荧光。经ETS干预24 h后，各组均可见大量凋亡细胞，且随浓度的增加，凋亡细胞比例升高。早期凋亡的细胞仅在细胞膜处呈绿色荧光，细胞核不着色；中、晚期凋亡的细胞则细胞膜处呈现绿色荧光，细胞核处呈现红色荧光。结果见图2。

4.4 辽东楤木叶总皂苷对人结肠癌HT-29细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响

与对照组比较，各浓度ETS组可见Bcl-2蛋白表达显著降低、Bax蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01），见表2。Bcl-2形态学表现为胞膜及胞浆中棕黄色颗粒减少，见图3；Bax形态学表现为胞膜及胞浆中棕黄色颗粒增多，见图4。

5 讨论

中药辽东楤木具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效，可用于治疗神经衰弱、风湿性关节炎、肝炎、糖尿病等肾气不足之证[3]。现代药理研究显示，ETS具有抑制癌细胞生长的作用[4]，对人结肠癌HT-29细胞作用尤为显著[5]。但其是否与诱导细胞凋亡有关尚不明确，本研究通过检测凋亡相关指标进一步探讨其对人结肠癌HT-29细胞的作用机制。

细胞凋亡异常与许多疾病尤其是癌症的发生发展有着密切关系。近年来，运用细胞凋亡手段研究中药抗癌机制成为热点[6-7]。Hoechst33258染色是通过对细胞核染色质进行染色对细胞核的形态进行观察。本实验结果显示，经ETS干预的细胞出现不同程度致密浓染颗粒且在一定范围内与浓度呈正相关，表明ETS具有诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的作用。

AnnexinV-FITC/PI双染法是区分凋亡早期及中晚期细胞的有效方法。本实验结果显示，不同浓度ETS对HT-29细胞均可产生诱导凋亡的作用，且随浓度的增加中晚期凋亡细胞增加。

肿瘤的发生、发展与细胞的过度增殖、正常凋亡受到抑制两个因素相关。因此，研究凋亡相关蛋白的表达成为研究抗肿瘤药物作用机制的重要途径之一[8]。Bcl-2是目前发现最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，而Bax作为Bcl-2家族的一员，具有Bcl促细胞凋亡功能，Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡[9]。本研究发现，不同浓度ETS能影响HT-29细胞Bcl-2和Bax的表达，其中Bcl-2蛋白表达显著下降，而Bax蛋白表达显著上升。

综上，本研究结果表明，ETS具有诱导人结肠癌HT-29细胞产生凋亡的作用，其机制可能与其调节凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达相关。

参考文献：

[1] 伍雯，秦环龙.膳食结构改变与结肠癌风险相关性的研究进展[J].肠外与肠内营养，2014，21（1）：55-59.

[2] 尹丽颖，边晓燕，肖洪彬.辽东楤木叶总皂苷对荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究[J].中医药信息，2010，27（3）：107-109.

[3] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977：2583.

[4] 王旭彤，王玲.辽东楤木皂苷体内外抗肿瘤作用的实验研究[J].黑龙江医药，2007，20（3）：210-211.

[5] 尹丽颖，李凤金，边晓燕，等.辽东楤木叶总皂苷对结肠癌HT-29细胞的生长抑制作用及机制研究[J].中国药理学通报，2013，29（11）：1545- 1548.

[6] 李忠，刘耀，李洁，等.中医肿瘤学科现状分析与发展思路[J].中医学报，2010，25（1）：10-16.

[7] 龙石银，张彩平，高细强，等.NF-κB/IKB在二苯乙烯苷抑制过氧化氢诱导内皮细胞凋亡中的表达变化[J].中国药理学通报，2011，27（10）：1353-1357.

[8] 张欣，李蕊洁.中药调控肿瘤细胞凋亡相关基因的研究进展[J].湖南中医杂志，2015，31（5）：196-197.

[9] 朱玲，羅颂平，许丽绵，等.左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J].中药新药与临床药理，2012，23（4）：381-386.

（收稿日期：2016-06-21）

（修回日期：2016-07-29；编辑：华强）endprint