斑马鱼血栓模型在中药抗血栓活性筛选中的适用性研究

樊娇娇，乔艺涵，赵崇军，倪媛媛，杨冉，冯娅茹，马志强，林瑞超



斑马鱼血栓模型在中药抗血栓活性筛选中的适用性研究

樊娇娇，乔艺涵，赵崇军，倪媛媛，杨冉，冯娅茹，马志强，林瑞超

北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102

目的 考察斑马鱼血栓模型在中药抗血栓活性筛选中的适用性。方法 采用盐酸肾上腺素诱导建立活体斑马鱼血栓模型。将斑马鱼随机分为空白组、模型组、阳性对照组、给药组，各组给予相应药物或胚胎培养水。16 h后，用邻联茴香胺染色液染色，计算斑马鱼心脏红细胞染色强度，进行定量分析；观察转基因斑马鱼血小板聚集情况，进行定性分析。结果 与模型组比较，100 μg/mL丹酚酸B，300、900 μg/mL丹参水提取物，45 μg/mL 95%乙醇提取物，400、1200 μg/mL消栓通络片均能明显抑制斑马鱼的血栓形成（＜0.01）。结论 斑马鱼血栓模型对中药抗血栓活性筛选具有良好的适用性。

斑马鱼血栓模型；中药；活性筛选；适用性

从中药中发现抗血栓活性显著的先导化合物已成为新药研发的一个重要途径。但中药化学成分复杂，用药形式多样，并且目前抗血栓药物筛选主要采用体外凝血实验和传统啮齿类动物在体血栓模型。前者只能针对部分靶点[1]，后者在进行活性筛选时，所需动物数量大、操作复杂、周期长，尚不适用于抗血栓药物的大规模筛选[2]，使中药抗血栓活性成分的筛选成为难题。而斑马鱼作为一种新的动物模型，具有养殖成本低，发育周期短，幼鱼透明易观察，产卵量大等独特的优势[3]。且Williams C H等[4]研究发现，斑马鱼与人类血液系统中的血小板和凝血因子有许多共同的特点，因此，逐步成为抗血栓药物筛选的模型生物。本研究采用盐酸肾上腺素诱导建立斑马鱼血栓模型，筛选不同形式中药（单体成分、中药提取物、复方）的抗血栓活性[5]，进而探讨斑马鱼血栓模型在中药活性筛选中的适用性，为斑马鱼模型用于复杂的中药化学成分体系活性物质筛选提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

AB系斑马鱼和血小板荧光标记转基因斑马鱼（CD41：GFP），购自国家斑马鱼中心，饲养于本实验室循环养殖系统。

1.2 药物

丹酚酸B，成都克洛玛生物科技有限公司，批号115939-25-8；丹参，北京同仁堂股份有限公司，批号501003818，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》标准；消栓通络片，北京同仁堂股份有限公司，批号15120192。

1.3 主要试剂与仪器

盐酸肾上腺素（上海源叶生物科技有限公司，批号Y03J7C15662），阿司匹林[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号50-78-2]，邻联茴香胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号119-90-4），二甲基亚砜（DMSO，西陇化工股份有限公司，批号160306），其他试剂均为分析纯。斑马鱼循环水养殖系统（北京爱生科技公司），1000、5000 μL移液器（Eppendorf），LRH-250Z恒温培养箱（广州瑞明仪器有限公司），DZF-6050B真空干燥箱（上海恒科学仪器有限公司），SMZ64型体视显微镜（尼康株式会社），80i生物荧光显微镜（尼康株式会社）。

2 实验方法

2.1 胚胎收集

成年斑马鱼由本实验室参照文献[6-7]方法养殖，温度控制在（28.5±1）℃，明暗周期14 h/10 h，定时喂养刚孵出的丰年虾。收集胚胎前1晚，挑选健康性成熟的斑马鱼，按雌雄1∶2比例放入交配缸内，次日清晨获得胚胎，用胚胎培养水将胚胎进行清洗后，放入28 ℃恒温控光培养箱内，每日更换胚胎培养水2次。

2.2 样品制备

2.2.1 胚胎培养水 按照文献[6]的标准配制。

2.2.2 单体成分 精密称取丹酚酸B 15 mg，溶于胚胎培养水中，获得3000 μg/mL的样品母液，给药前再用胚胎培养水稀释至不同浓度。

2.2.3 单味中药 根据含丹参成方制剂的制备过程中丹参的常用提取方法进行制备[8]。取丹参饮片粉碎，过40目筛，称取2份100 g粉末，分别加入10倍量水、95%乙醇，回流提取2次，每次2 h，过滤，合并提取液，减压浓缩，真空干燥。精密称取2种提取物各30 mg，溶于0.03 mL DMSO，再加胚胎培养水9.97 mL，获得3000 μg/mL样品母液，给药前再用胚胎培养水稀释成不同浓度的溶液，并保证筛选体系中DMSO终体积分数不高于0.1%[9]。

2.2.4 复方 取消栓通络片，粉碎，过80目筛，精密称取30 mg，加入胚胎培养水，超声处理30 min，过滤，制成3000 μg/mL样品母液，给药前再用胚胎培养水稀释至不同浓度。

2.3 造模和分组

在体视显微镜下挑选发育正常的72 hpf（hours post-fertilization）斑马鱼幼鱼，并将其随机置于含有3 mL胚胎培养水的6孔板中，每孔30条。除空白组斑马鱼继续正常养殖不予造模外，其余斑马鱼用终浓度为15 μmol/L的盐酸肾上腺素溶液避光处理16 h，用邻联茴香胺染色液染色，以斑马鱼尾静脉血栓的形成，心脏红细胞染色强度的减少为指标，证实斑马鱼血栓模型造模成功。将板孔按顺序编号，按随机数字表法分为模型组、阳性对照组和中药各剂量组，每组3孔。

2.4 给药

根据预实验结果，设丹酚酸B浓度为100、35、10 μg/mL，丹参水提取物浓度为900、300、90 μg/mL，丹参95%乙醇提取物浓度为45、15、4.5 μg/mL，消栓通络片浓度为1200、400、120 μg/mL。给药组斑马鱼给予上述浓度的试药，空白组斑马鱼给予胚胎培养水，阳性对照组斑马鱼给予10 μg/mL阿司匹林溶液，置于28.5 ℃恒温生化培养箱中。取不同亲本斑马鱼幼鱼重复实验3次。

2.5 心脏红细胞染色强度检测

已有国家专利（国家专利号：201110126427.2）报道斑马鱼尾静脉血栓形成的程度与心脏红细胞数（红细胞染色强度）成反比[2]。因此，本实验用邻联茴香胺染色液对斑马鱼染色，通过计算斑马鱼心脏红细胞染色强度的方法，对中药抗血栓活性进行定量分析。染色液配制：精密称取邻联茴香胺30 mg、醋酸钠41 mg，置50 mL容量瓶中，加35%过氧化氢溶液1.1 mL，再用40%乙醇定容，摇匀[10]。在实验终点，从每组随机抽取10条斑马鱼，用现配的邻联茴香胺染色液染色30 min，再用DMSO清洗3次，用自制发圈将幼鱼取出，侧位放置于双凹载玻片上，置于镜下对心脏进行拍照。应用Image-Pro Plus 6图像处理软件统计斑马鱼红细胞染色强度，进行定量分析。

2.6 尾静脉血小板荧光聚集检测

取72 hpf的Tg（-6.0itga2b：EGFP）斑马鱼幼鱼按“2.3”项下处理，在实验终点，使用麻醉剂将斑马鱼麻醉，镜下观察斑马鱼体内血小板聚集情况并拍照，评价试药对斑马鱼血小板聚集的抑制作用。

3 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。实验数据以±表示，组间比较采用方差分析。＜0.01表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 丹酚酸B对斑马鱼血栓形成的影响

与空白组比较，模型组斑马鱼心脏红细胞染色强度明显减少（＜0.01），表明建模成功；与模型组比较，阳性对照组斑马鱼心脏红细胞染色强度增加（＜0.01）。低浓度（≤35 μg/mL）丹酚酸B溶液未表现出血栓抑制作用，而100 μg/mL丹酚酸B组斑马鱼与模型组比较，心脏红细胞染色强度增加（＜0.01），表现出显著的抑制血栓形成的作用。结果见表1。

表1 丹酚酸B对斑马鱼血栓形成的影响（±s）

注：与空白组比较，*＜0.01；与模型组比较，##＜0.01

4.2 丹参不同提取物对斑马鱼血栓形成的影响

丹参不同提取物在实验条件下均显示出有抑制斑马鱼血栓形成的作用。丹参水提物浓度≥300 μg/mL时，斑马鱼心脏红细胞染色强度与模型组比较差异有统计学意义（＜0.01），但在90 μg/mL时，未表现出抑制血栓形成的作用；其95%醇提物在低剂量时（≤15 μg/mL），也未表现出抑制血栓的作用，但随着浓度的升高，其抑制作用增强，45 μg/mL时，与模型组比较差异有统计学意义（＜0.01）。结果见表2。

表2 丹参提取物对斑马鱼血栓形成的影响（±s）

注：与空白组比较，*＜0.01；与模型组比较，##＜0.01

4.3 消栓通络片对斑马鱼血栓形成的影响

消栓通络片在120 μg/mL时，对斑马鱼血栓形成无明显影响，但随着剂量的增加其抑制血栓作用明显增加，在浓度≥400 μg/mL时，与模型组比较差异有统计学意义（＜0.01），能显著抑制斑马鱼血栓的形成。结果见表3。

表3 消栓通络片对斑马鱼血栓形成的影响（±s）

注：与空白组比较，*＜0.01；与模型组比较，##＜0.01

4.4 斑马鱼尾静脉血小板荧光聚集检测结果

空白组无血小板聚集，模型组血小板聚集明显增多，阳性对照组聚集减少，给药组血小板聚集程度与上述各组斑马鱼心脏红细胞的染色强度相反，即2种方法得到的各组血栓形成结果一致。结果见图1。

注：A.空白组；B.模型组；C.阳性对照组；D.100 μg/mL丹酚酸B组；E.35 μg/mL丹酚酸B组；F.10 μg/mL丹酚酸B组；G.900 μg/mL丹参水提物组；H.300 μg/mL丹参水提物组；I.90 μg/mL丹参水提物组； J.45 μg/mL丹参95%醇提物组；K.15 μg/mL丹参95%醇提物组； L.4.5 μg/mL丹参95%醇提物组；M.1200 μg/mL消栓通络片组； N.400 μg/mL消栓通络片组；O.120 μg/mL消栓通络片组

5 讨论

血栓形成是导致心脑血管疾病的重要因素。活血化瘀类中药具有良好的抗血栓活性，已被广泛应用于临床，并且从中药中筛选出良好的抗血栓物质，进行药物研发，已引起国内外的普遍重视。随着斑马鱼血栓模型研究的深入，其逐步成为抗血栓药物筛选的模型生物。Zhu X Y等[2]研究发现，一些临床常用抗血栓药物如盐酸地尔硫卓注射液、黄芪注射液、华法林钠等作用于斑马鱼的药效与在哺乳动物中的相近，说明利用斑马鱼模型筛选抗血栓药物的有效性。中药是一个多成分的复杂体系，有着多成分、多靶点的作用特点。斑马鱼血栓模型能否应用于中药这种复杂体系，并且如何评价中药的抗血栓活性，已成为药物筛选工作者关注的问题。

丹酚酸B是从丹参中提取出的一种具有抗血栓活性的成分，通过抑制凝血酶、花生四烯酸等阻止血小板活化[11]，对心脑血管疾病具有治疗作用。本实验结果显示，丹酚酸B对斑马鱼血栓形成也具有明显的抑制作用，模型适用性良好。根据含丹参成方制剂的制备过程中丹参的常用提取方法，实验采用水和95%乙醇回流提取的方法，获得丹参的不同提取成分，进行活性评价。不同丹参提取物在一定剂量下对斑马鱼血栓形成均有较强的抑制作用。中药复方由多味中药组成，比单味中药的化学成分体系更为复杂。本实验采用斑马鱼血栓模型考察中药复方对血栓形成的影响，结果显示，消栓通络片对斑马鱼血栓形成有明显的抑制作用，与张冉等[12]采用小鼠、大鼠研究消栓通络方的结果相符，说明在抗血栓药物的筛选与评估方面，斑马鱼血栓模型与传统动物血栓模型的效应相似。

实验利用血小板荧光标记的转基因斑马鱼和斑马鱼早期幼鱼透明的特点，荧光显微镜下对斑马鱼血流速度和血小板聚集情况进行可视化追踪与定性分析，发现给药组斑马鱼与模型组比较，血流速度明显增加，血小板聚集明显减少。推测丹参可能是通过加快血流速度和抑制血小板活化来诱导斑马鱼血栓形成，这与临床应用丹参治疗血栓性疾病的机制相似。因此，斑马鱼血栓模型能较好地模拟中药抑制血栓形成的过程，有望用于中药抗血栓机制的研究。

综上所述，已知具有抑制血栓形成作用的中药单体成分、提取物、复方在斑马鱼血栓模型上显示了抗血栓作用。斑马鱼与传统的啮齿类动物小鼠、大鼠等相比，具有诸多优势。此外斑马鱼对DMSO有良好的耐受性，溶解性较差的药物可溶解在DMSO中通过皮肤扩散吸收[13]。因此，斑马鱼血栓模型对不同层次中药形式的抗血栓活性筛选具有良好的适用性，可为中药抗血栓活性的筛选与新药研发提供高通量和重复性良好的模型生物。

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Applicability of Zebra Fish Thrombosis Model in Antithrombotic Activity Screening of Chinese Materia Medica

FAN Jiao-jiao, QIAO Yi-han, ZHAO Chong-jun, NI Yuan-yuan, YANG Ran, FENG Ya-ru, MA Zhi-qiang, LIN Rui-chao

Objective To investigate the applicability of zebra fish thrombosis model in antithrombotic activity screening of Chinese materia medica. Methods The living zebra fish thrombosis model was induced by adrenaline hydrochloride. Zebra fish were randomly divided into blank control group, model group, positive medicine group and medication group. Each group was given the corresponding medicine or embryo culture water. O-anisidine staining solution was used to stain and calculate the staining intensity of erythrocytes in zebra fish heart, and quantitative analysis was carried out. The platelet aggregation of transgenic zebra fish was observed and under qualitative analysis. Results Compared with the model group, 100 μg/mL salvianolic acid B, 300, 900 μg/mL aqueous extract of Salvia miltiorrhiza, 45 μg/mL 95% ethanol extract and 400, 1200 μg/mL hypothalamus could significantly inhibited the formation of zebra fish thrombosis (<0.01). Conclusion Zebra fish thrombosis model has good applicability in antithrombotic activity screening of Chinese materia medica.

zebra fish thrombosis model; Chinese materia medica; activity screening; adaptability

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.014

R285.5

A

1005-5304(2017)07-0058-04

北京市科委创新环境与平台建设专项（Z16111000500000）

林瑞超，E-mail：linrch307@sina.com；马志强，E-mail：mazq1968@sina.com

（2016-11-15）

（2016-12-02；编辑：华强）