决明子冻干粉对SD大鼠的长期毒性研究

魏若尧　裴彦宇　孙井江

[摘要] 目的 研究大鼠连续1年长期摄入决明子冻干粉的毒性，为人体食用提供参考依据。 方法 实验选用SPF级SD大鼠480只，雌雄各半。随机分为4组，每组120只。分别为：溶媒对照组（纯净水）、低剂量组（0.5 g生药/kg BW）、中剂量组（2.2 g生药/kg BW）、高剂量组（10.0 g生药/kg BW）。给药体积：1 mL/100 g，每周给药6 d，每天给药1次，连续给药52周，口服（灌胃）给药。每周进行体重和摄食量的测定。动物在给药第13、26、39、52周以及给药26、52周停药恢复4周后，各组分别剖杀20只，雌雄各半。进行血液学、血清生化学测定，剖解主要脏器进行脏器重量称量，计算脏器重量及脏器系数，并对各剂量组脏器进行组织病理学检查。 结果 ①在整个试验周期中未发生因给予决明子药物本身引起的大鼠濒死和死亡的毒性反应。②各给药剂量组及对照组大鼠体重均增长，呈现出一定的剂量-反应关系。③大鼠连续灌胃给予决明子26周，中剂量、高剂量组雌性大鼠以及高剂量组雄性大鼠的总胆红素偏低（P < 0.01），且恢复4周后，高剂量组雄性大鼠的总胆红素依旧偏低（P < 0.01）。给药39周后高剂量组雌性与雄性大鼠的总膽红素偏低（P < 0.05或P < 0.01）；给药52周后高剂量组雄性大鼠的三酰甘油比对照组显著性降低（P < 0.05），恢复4周后恢复正常。大鼠连续灌胃给予决明子26及39周，中剂量、高剂量组雄性大鼠的肾脏系数显著性高于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。④SD大鼠连续灌胃决明子26、39、52周后，在高剂量组出现毒性的靶器官是肾脏，且肾脏毒性不可逆，在低剂量组和中剂量组未出现明显的毒性反应。 结论 本试验室条件下，决明子冻干粉的未发生毒性反应的剂量为2.2 g生药/kg BW，在高剂量（10.0 g生药/kg BW）下的毒性靶器官主要是肾脏。

[关键词] 决明子冻干粉；长期毒性；未发生毒性反应的剂量；毒性靶器官

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0004-06

[Abstract] Objective To evaluate the chronic toxicity of Semen Cassiae freeze-dried powder in rats. Methods 480 SD rats were randomly divided into 4 groups （60 male and 60 female per group）： control group （pure water）， low-dose group （0.5 g/kg BW）， mid-dose group （2.2 g/kg BW） and high-dose group （10.0 g/kg BW）. The volume of drug for gavaging was 1.0 mL/100 g. animals were administrated with drug by 6 days every week for 52 weeks. Subsequently， the weight and foodintake were examined per week. Meanwhile， hematology， blood biochemistry， organ weight， organ coefficient and histopathology were detected on 13-week， 26- week， 39-week and 52-week， and stopping drug at the end of 26-week， 52-week following by 4 weeks recovery period with killing 20 rats in each group. Results ①The result showed there was no death case in each group. ②The weight of rats in dose groups and control group were increased， and it showed dose-related. ③Compared with the control group， the total bilirubin of male rats in mid-dose and high-dose group were lower after 26 weeks （P < 0.01）， after recovery period the TBIL of male rats in high-dose group was still lower （P < 0.01）. After 39 weeks treatment， the TBIL in high-dose group lower compared with the control group （P < 0.05 or P < 0.01）； The triglyceride of male rats in high-dose group was lower after 52 weeks（P < 0.05） and returned to normal after recovered 4 weeks. On 26 weeks and 39 weeks， there were significant increased in relative kidney weights of male rats in mid-dose group and high-dose group compared with control group （P < 0.05 or P < 0.01）. ④The toxic target organ in high-dose group was kidney on 26， 39， 52 weeks， and the toxicity was irreversible， no toxic showed in low-dose group and mid-dose group. Conclusion The no-observed-adverse-effect level for Semen Cassiae freeze-dried powder was 2.2 g/kg BW in rats， and the toxic target organ in high-dose （10.0 g/kg BW） group was kidney.

[Key words] Semen Cassiae freeze-dried powder； Chronic toxicity； No-observed-adverse-effect level； Toxic target organ

决明子（Cassiae Semen）是豆科植物决明（Cassia obtusifo-lia L.）或小决明（Cassia tora L.）的干燥成熟种子，其味甘、苦、咸，性微寒，多用于治疗目赤肿痛、羞明多泪、头疼眩晕、目暗不明、大便秘结等。现代医学研究表明，决明子含有多种化学成分[1]，包括蒽醌类、萘并吡喃酮类、脂肪酸类、糖类、氨基酸和无机元素，其中蒽醌类成分是主要有效成分。药理研究表明，决明子中的蒽醌类成分具有泻下作用[2]、降压作用[3]、降脂作用[4]、抗菌作用[5]及免疫调节作用[6]等。同时有研究表明[7]，长期使用含蒽醌类化合物的中药会引起结肠黑变病，也会产生泌尿系统毒性[8]及生殖系统毒性[9]。

中药保健食品在我国的发展历史相对短暂，尤其是对中药原料长期使用的安全性评价研究基础薄弱。決明子常作为水煎服或代茶饮的保健类食品，其安全性得到了越来越广泛地关注。目前，国内外缺少对决明子原料药长期少量食用的安全性评价数据，人体长期使用含有蒽醌类成分中药原料的保健食品是否存在安全性问题尚无定论。本研究拟阐明决明子原料药用于保健食品长期食用的安全性，将进一步完善决明子重要原料保健食品的审评规定，并促进保健食品产业的发展，加快中医药现代化和国际化过程，提高中医药医疗服务能力和产业技术水平，丰富和完善中医医疗保健模式。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品

决明子冻干粉[无限极（中国）有限公司，批号：Y41407045]深棕色粉末，密闭，防潮保存。1 g冻干粉相当于9.375 g生药材。临用前用纯净水配成相应浓度溶液。

1.1.2 实验动物

SPF级SD大鼠480只，雌雄各半，80～100 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。动物饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所SPF级环境中，温度范围在22～26℃，相对湿度40%～70%，换气次数15次/h，照明>200 lux。动物合格证号：SYXK（京）2014-002。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方案

实验选用SPF级SD大鼠480只，雌雄各半。随机分为4组，每组120只。分别为：溶媒对照组（纯净水）、低剂量组（0. 5g生药/kg BW）、中剂量组（2.2 g生药/kg BW）、高剂量组（10.0 g生药/kg BW），分别相当于人体推介量等效剂量的0.5、2.3、10.7倍。（人体重按照60 kg计算）。对照组给予等体积纯净水。给药体积为1.0 mL/100 g，每周给药6 d，每天给药1次，连续给药52周，口服（灌胃）给药。

1.2.2 检测指标

1.2.2.1 大体观察、体重和摄食量的测定 每日定时观察动物的外观和行为（包括精神状态、皮肤毛发、眼睛和粘膜的变化、活动情况、呼吸状况、死亡情况及其他异常表现）、分泌物和排泄物等。每周称体重和摄食量。

1.2.2.2血常规、血生化指标检测 分别在给药13、26、39、52周以及26、52周后停药4周时，剖杀20只/组，雌雄各半，腹主动脉取血。抗凝血用于血常规的测定，测定指标包括白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容、红细胞平均体积等共16项指标；非抗凝血血清用于血清生化学指标的测定，测定指标包括丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸氨基转移酶、尿素氮、血糖及钾离子、氯离子等14项指标。

1.2.2.3 脏器系数及病理组织学检查 解剖动物处死后，进行完整的系统解剖，称量心、肝、脾、肺、肾、睾丸、子宫等组织脏器并计算脏器系数。组织器官采用10%中性甲醛固定液固定、石蜡包埋、HE染色、封片后显微镜下观察各脏器的组织学变化。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，先进行方差分析，方差齐时采用Dunnett-t检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察、体重和摄食量的测定

在决明子灌胃实验中未发生因给予决明子药物本身引起的大鼠濒死和死亡的毒性反应。但随剂量的增加，动物的排便次数、排尿次数增多。在整个试验周期中，各组大鼠体重均增长，且增长速度依次为：对照组组>低剂量组>中剂量组>高剂量组。见图1。给药第6周至给药第52周，高剂量组雄性与雌性大鼠的体重增长速度与对照组动物相比，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而停药后增长速度差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 血液学指标检测

大鼠连续灌胃给予决明子13周后，中剂量组雌性大鼠红细胞计数显著低于对照组（P < 0.05），且雌性大鼠各个剂量组RBC均有降低趋势。大鼠连续灌胃给予决明子26周后，各给药剂量组雄性大鼠网织红细胞百分比偏低；且停药4周后，网织红细胞百分比恢复正常。但在39周时未观察到此现象。大鼠连续灌胃给予决明子52周，各组血液学指标差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1～6。

2.3 血清生化学指标检测

大鼠连续灌胃给予决明子13周后，高剂量组大鼠的总胆红素偏低（P < 0.01）。大鼠连续灌胃给予决明子26周及39周后，中、高剂量组雌性大鼠以及高剂量组雄性大鼠的总胆红素偏低（P < 0.05或P < 0.01），且26周恢复4周后，高剂量组雄性大鼠的总胆红素依旧偏低（P < 0.01）。大鼠连续灌胃26周后，低、中剂量组雄性大鼠和中剂量组雌性大鼠三酰甘油偏低（P < 0.05），且给药26周后恢复4周后，均恢复正常。但在39周时未观察到此现象。大鼠连续灌胃给予决明子52周后，高剂量组雌性大鼠三酰甘油偏低（P < 0.01），且恢复4周后，恢复正常。见表7～12。

2.4 对脏器系数的影响

大鼠连续灌胃给予决明子26及39周，中、高剂量组雄性大鼠的肾脏系数均不同程度地显著性高于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。但在52周时未观察到此现象。见表13。

2.5 病理学检测

决明子给予SD大鼠13周后各受检脏器未见明显的病理改变。高剂量给予SD大鼠26周、39周及52周后可引起肾脏近曲小管上皮细胞内色素沉积，并可能引起肾小管萎缩及再生；26周停药4周后及52周恢复4周后肾脏近曲小管上皮细胞内色素沉积仍存在；其余各受检脏器未见与供试品有关的病理改变。中剂量灌胃给予SD大鼠39周及52周后可引起少数动物肾脏近曲小管上皮细胞内色素沉积；其余各受检脏器未见与供试品有关的病理改变；52周恢复4周后肾脏近曲小管上皮细胞内色素沉积仍存在。中剂量及低剂量给予SD大鼠26周及停药4周后各受检脏器未见与供试品有关的病理改变。见图2。

3 讨论

《中华人民共和国药典》中规定决明子的人体推荐量是9～15 g/d[10]，是卫计委公布的69种“药食同源”的保健品之一[11]。决明子中含有多种化学成分[12-17]，蒽醌类成分是其主要生物活性有效成分，它在表现出多种有效成分的同时，也表现出多种毒副作用。美国“国家毒理学计划”研究表明，在蒽醌剂量超过170 mg/kg（相当于药典中推荐使用下限剂量的50倍）时可引起动物肝、肾、膀胱等脏器肿瘤，以及脾、肾等组织器官病理学损伤[8]。由于此试验受试物为从原料药中提取的蒽醌类物质，且给药剂量远远高于该原料在中药或保健食品中的常规用量，既不能完全反映中药原料药中全部成分的作用，也不能适用于以少量、长期食用为特点的保健食品。同时，国内外目前尚还没有关于决明子长期食用的安全评价数据。因此，本研究进行了SD大鼠经口灌胃给予不同剂量的决明子52周，观察给药13、26、39、52周，给药26周以及给药52周后恢复4周出现毒性反应的靶器官，阐明长期食用决明子后是否存在安全性隐患。

在本实验中， 剂量设置依据为决明子冻干粉在能通过灌胃针的情况下，最大溶解度为10.0 g生药/kg BW，将该剂量作为高剂量（相当于人体用量96 g）；低剂量旨在不出现毒性，故低剂量组的设计参考药典中规定的决明子人体推荐量下限值（9 g）的1/2，再根据大鼠相对于人的等效剂量6.25进行换算，即0.5 g生药/kg BW。中剂量则按照等比关系插入，即2.2 g生药/kg BW。

在整个试验周期中，各给药剂量组及对照组大鼠体重增长速度呈现出一定的剂量-反应关系。可能主要是由于决明子的泻下作用，减少了肠道对营养物质的吸收并增加了对营养物质的排泄[18]；同时也与药物剂量有关，提示决明子对大鼠体重有影响，有减肥的功效。

在给药26周后，给药组的TBIL指标呈现出一定的有统计学意义差异（P < 0.05或P < 0.01），有研究表明总胆红素过低与缺铁性贫血有关[19]，还有待进一步观察和研究。给药52周后给药组的血常规、血生化及离子指标均趋于正常，提示决明子可能会引起轻度贫血，且是可逆的。

给药52周后，在10.0 g生药/kg BW剂量下发生大鼠肾脏近曲小管上皮细胞内色素沉积，以及引起肾小管萎缩及再生等病理组织学改变，停药恢复4周后，这种现象虽有所缓解但仍然存在。这表明长期服用决明子在超过一定剂量时的毒性靶器官主要是肾脏，而在低剂量下是安全的。

綜上所述，在本试验室条件下，SD大鼠连续灌胃决明子冻干粉52周，其未观察到损害作用的剂量为2.2 g生药/kg BW（相当于人体用量的8.8倍），在10.0 g生药/kg BW剂量下（相当于人体用量的18.2倍）的毒性靶器官主要是肾脏。中药保健食品在我国的发展历史相对短暂，其相关研究也开展得很少，尤其是对中药原料长期食用的安全性评价研究基础薄弱，这一研究结果可为制订含相关中药原料保健食品的技术审评要点、申报指导原则等提供理论依据。

[参考文献]

[1] 裴妙荣，贾宏伟，王世明.生、炒决明子蒽醌含量比较[J].中国中药杂志，1990，15（8）：29.

[2] 郭金华.近年来决明子的药理药化临床研究进展[J].中国中医药信息杂志，1999，6（12）：23-25.

[3] 李续娥，郭宝江，曾志，等.决明子蛋白质、低聚糖及蒽醌苷降压作用的实验研究[J].中草药，2003，34（9）：842-843.

[4] Patil UK，Saraf S，Dixit VK. Hypolipidemic activity of seeds of Cassia tora Linn [J]. J Ethnopharmacol，2004，90（2-3）：249-252.

[5] 程玲玲，孙梅，涂凌.决明子提取物对植物病原菌的抑菌活性初探[J].四川理工学院学报：自然科学版，2005，2（18）：53-55.

[6] 邓响潮，孙桂波，宋威.决明子蒽醌苷对小鼠免疫功能的调节作用[J].药物研究，2008，17（11）：10-11.

[7] Benavides SH，Morgante PE，Monserrat AJ，et al.The pigment of melanosis coli：a lectin histochemical study [J]. Gastrointest Endosc，1997，46（2）：131-138.

[8] National Toxicology Program（NTP）.Toxicology and carcin-ogenesis studies of emodin（CAS NO：1518-82-1）feed Studies in F344/N rats and B6C3FI mice[J].Natl Toxical Program Tech Rep Ser，2001，493：1-278.

[9] 周宇红，汪会玲，杨华，等.决明子亚慢性毒性病理实验[J].毒理学杂志，2006，19（3）：265-266.

[10] China Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China [M]. Beijing：China Chemical Industry Press，2010：87.

[11] 郭金华.近年来决明子的药理药化临床研究进展[J].中国中医药信息杂志，1999，6（12）：23-25.

[12] Drever BD，Anderson WG，Riedel G，et al. The seed extract of Cassia obtusifolia offers neuroprotection to mouse hippocampal cultures [J]. J Pharmacol Sci，2008，107（4）：380-392.

[13] Huang YL，Chow CJ，Tsai YH. Composition，characteristics，and in-vitro physiological effects of the water-soluble polysaccharides from Cassia seed [J]. Food Chem， 2012，134（4），1967-1972.

[14] Xie Q，Guo FF，Zhou W. Protective effects of cassia seed ethanol extract against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice [J]. Acta Biochem Pol，2012，59（2）：265-270.

[15] Wang J，Zhao Y，Xiao X，et al. Assessment of the renal protection and hepatotoxicity of rhubarb extract in rats [J]. J Ethnopharmacol，2009，124（1）：18-25.

[16] Shang M，Zhang X，Dong Q，et al. Isolation and structural characterization of the water-extractable polysaccharides from Cassia Obtusifolia seeds [J]. Carbohydr Polym，2012， 90（2）：827-832.

[17] Zhang WD，Wang Y，Wang Q，et al. Quality evaluation of Semen Cassiae （Cassia obtusifolia L.） using ultra-high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry [J]. J Sep Sci，2012，35（16）：2054-2062.

[18] Xie W，Zhao Y，Du L. Emerging approaches of traditional Chinese medicine formulas for the treatment of hyper-lipidemia [J]. J Ethnopharmacol，2012，140（2）：345-367.

[19] Voss KA，Brennecke LH. Toxicological and hematological effects of sicklepod （Cassia obtusifolia） seeds in Sprague-Dawley rats： a subchronic feeding study [J]. Toxicon，1991， 29（11）：1329-1336.

（收稿日期：2017-01-11 本文編辑：苏 畅）