龙血素B对牛蛙坐骨神经干兴奋传导的影响

马鹏飞++潘鑫鑫++万莹++陈素

摘要：为研究龙血竭的有效成分龙血素B对牛蛙坐骨神经-腓肠肌的影响，采用不同浓度的龙血素B作用于牛蛙坐骨神经-腓肠肌标本，观察和分析了给药前后坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值。研究结果表明：不同浓度的龙血素B单体均能抑制坐骨神经-腓肠肌的最大收缩幅值，抑制率随着药物浓度增加而加强，到0.25 mg/mL浓度时达到最大抑制效果。龙血素B可能是通过影响坐骨神经干上的电压门控钠离子通道，进而影响坐骨神经干上动作电位的产生和传递，抑制腓肠肌的收缩。

关键词：龙血素B；坐骨神经；电压门控钠离子通道；动作电位

中图分类号：R337.3

文献标识碼：A 文章编号：16749944（2017）10021503

1 引言

龙血竭是百合科植物剑叶龙血树的红色树脂，作为传统名贵民族药物，具有活血化瘀、定痛止血、敛创生肌等功效[1]，普遍认为龙血竭的有效成分为一类黄酮类化合物，其中龙血素B是鉴别龙血竭的指标性成分[2]。以往的电生理实验指出龙血竭是通过调制背根神经节上的电压门控钠离子通道影响痛觉信号的传入起到镇痛的作用，并且龙血素B等黄酮类物质是调制电压门控钠离子通道的主要作用因子[3]，而并不清楚龙血素B在组织中的镇痛效果和作用方式。酰胺类局麻药通过可逆结合电压门控钠离子通道阻滞钠离子内流从而抑制动作电位产生引起局部肌肉麻醉的机制[4]提供了一个可行的研究方案。本研究采用不同浓度的龙血素B溶液作用牛蛙坐骨神经-腓肠肌标本，利用生物机能实验系统采集坐骨神经-腓肠肌不同时间点的最大收缩幅值并进行分析，间接证明龙血素B对牛蛙外周神经兴奋传导的调制效果以验证其在组织中的作用效果是否与在细胞实验中具有一致性。

2 材料和方法

2.1 实验动物

牛蛙，不限雌雄，体重270±10 g，购买于湖北省实验动物中心。

2.2 实验仪器

四川泰盟科技BL-420E生物机能实验系统，肌张力换能器，刺激电极，神经标本屏蔽盒。

2.3 实验药品

实验中使用的龙血素B由广西壮族自治区中医药研究所提供，卢文杰教授鉴定。实验中按照一般实验溶液配制方法，将龙血素B加入任氏液中配制成不同浓度的溶液备用。溶液质量浓度分别为0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL。

2.4 实验方法

将实验用牛蛙按照常规方法制备成坐骨神经-腓肠肌标本，室温浸泡在任氏液中15min稳定后使用，神经肌肉标本随机分成6组，每组5条，神经干放置于肌槽上屏蔽盒中，坐骨神经端接入露丝刺激电极，每组神经干分别将坐骨神经端浸于任氏液中（空白对照）以及5种不同浓度溶液中，腓肠肌跟腱用扎线与肌张力换能器连接，连接后刺激测试初始肌张力，调整扎线松紧，确保每组初始肌张力值无明显差异。选择实验项目为刺激强度与反应的关系，将初始刺激强度设置为0 mV，增幅设置为5 mV，仅用任氏液浸泡坐骨神经干，进行刺激，记录0时刻和给药后5 min腓肠肌收缩曲线随后每2 min进行一次记录，直至33min共记录15个时间点收缩曲线，共记录5个标本，以观察时间对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的影响；后将浸泡液换为质量浓度分别0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL龙血素B溶液进行同样的刺激，观察给药前后各时间点最大收缩幅值，记录龙血素B溶液浸泡牛蛙坐骨神经干前后的坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值，以观察30 min以上仍收缩良好的坐骨神经-腓肠肌标本记录为有效记录。每种浓度的龙血素B溶液浸泡后药理效应的有效记录为5个标本。

2.5 数据分析和曲线拟合

2.5.1 数据分析

运用BL-420E生物机能实验系统中自带的测量功能在得到的收缩曲线上采集数据，获得每条曲线收缩最大幅值、最大刺激强度（产生收缩最大幅值时的刺激电压强度）以及阈刺激强度（肌肉开始收缩时的电压强度）。由于空白对照组收缩最大幅值、最大刺激强度、阈刺激强度在各时间点所得数据与0时刻三种数据值比较无显著性差异，将各时间点数据以0时刻数据作为标准进行归一化处理，使用归一化处理后的数值进行分析。同一浓度不同时刻数据用mean±sd表示，使用配对t检验和单因素方差分析进行检验，P<0.05作为显著性检验的标准，所有数据使用SPSS分析，igor pro作图。

2.5.2 曲线拟合

（1）药物坐骨神经药物浓度依耐性。药物对腓肠肌最大收缩幅值肌张力的百分比抑制率（Inhibition%）用式（1）表示：

（2）药物对坐骨神经组织中作用方式分析。在本实验室之前的细胞实验中发现，龙血素B对DRG细胞膜上的电压门控钠离子通道作用方式符合受体学说，因为动作电位的产生主要由钠离子内流形成，因此猜测龙血素B影响牛蛙坐骨神经干动作电位产生和传递也应该具有相同的药物作用方式，在此以药物对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的抑制率来描述药物的药理效应，因此药物在某一时刻t对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的抑制率Et为：

式（3）中，药物分子的量用L表示，t为时间，k1和k2分别为药物的结合与解离常数。用式（3）对药物作用牛蛙坐骨神经干的时效曲线进行拟合。

曲线拟合的卡方拟合优度检验以P<0.05作为显著性检验的标准。

3 结果分析

3.1 龙血素B对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的抑制效应

对未加入药物的腓肠肌最大收缩幅值进行归一化处理，并以各时刻值与初始时刻值进行配对t检验，结果显示各时刻P>0.05，最大收缩幅值随时间变化的曲线见图1。0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL的龙血素B溶液对骨骼肌的最大收缩幅值均具有抑制作用，最大抑制率分别为43±12.25%、58±2.82%、74±9.49%、73±3.39%。龙血素B对牛蛙坐骨神经最大收缩幅值的半效抑制浓度（IC50）为0.034 mg/mL（图2，3）。

3.2 龙血素B对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值时效

将0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL这3个浓度龙血素B浸泡后各时间点的最大收缩幅值以加药前最大收缩幅值为1进行归一化处理，并计算抑制率。结果显示0.05 mg/mL龙血素B处理后最大收缩幅值抑制率从距加药19 min时间点开始每个时间点均具有显著性差异，P<0.05；0.1 mg/mL龙血素B处理后最大收缩幅值抑制率從距加药5 min开始每个时间点均具有显著性差异，P<0.01；0.25 mg/mL龙血素B处理后最大收缩幅值抑制率从距加药7 min开始各时间点均具有显著性差异，P<0.01。这说明3种浓度的龙血素B溶液对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的抑制率随时间而变化。

为了验证龙血素B作用于神经组织是否与作用于细胞一样，符合受体学说，以加药时间点为横坐标，加药后11 min各时间点龙血素B对牛蛙坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的抑制率为纵坐标，作0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL三种浓度龙血素B抑制作用随时间变化的散点图，用式（3）对散点图进行拟合，作卡方拟合优度检验，结果显示三个浓度拟合结果P>0.05，3种浓度龙血素B的时效曲线拟合见图4。

4 结论

以往在大鼠，DRG细胞上的电生理实验表明，龙血竭及其药效物质龙血素B对初级感觉神经元上的电压门控的钠离子通道具有调制作用[3]，DRG细胞上的电压门控钠电流也被认为是引起其膜电位去极化的最初离子流[5]对其产生动作电位具有重要意义。在解剖学上，牛蛙的坐骨神经干连接外周神经，可将中枢神经产生的动作电位传递至外周神经进而通过神经肌肉接头，引起骨骼肌内质网的Ca2+释放最终引起骨骼肌收缩[6]。也有很多研究表明坐骨神经结扎的病理性痛觉模型会引起DRG神经元上电压门控钠离子通道的改变[7]，可见初级感觉神经元细胞上的电压门控钠离子通道是影响外周神经传导的重要因素。本实验正是通过测量和分析龙血素B严格作用坐骨神经干后坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅值的变化，从而间接地获取龙血素B作用神经干后对神经干中动作电位产生和传导的影响的信息，以探明龙血素B作用于神经组织后是否与龙血素B作用于DRG细胞细胞膜上的电压门控钠离子通道具有一致的作用效果和作用方式。

研究结果表明：龙血素B对牛蛙坐骨神经最大幅值的抑制与以往在DRG细胞上进行的电生理实验中龙血素B所表现的对电压门控钠离子通道电流峰值抑制的浓度依耐性关系基本一致[3，8]，但是龙血素B作用于DRG细胞对TTX-s型钠离子通道电流的半效抑制浓度约为0.01 mmol/L[8]，而龙血素B溶液作用于神经干引起坐骨神经-腓肠肌最大收缩幅度抑制的半效抑制浓度为0.034 mg/mL，这一浓度远大于龙血素B作用于DRG细胞时对钠电流峰值的半效抑制摩尔浓度。并且有趣的是龙血素B作用于组织时，不同浓度溶液浸泡坐骨神经干所表现的药物作用方式与推测并不一致，龙血素B的结合常数和解离常数在高浓度（0.25 mg/mL）溶液作用时相较于中等浓度（0.1 mg/mL）和低浓度（0.05 mg/mL）均表现出了明显的升高，这说明龙血素B在高浓度作用神经组织时能更有效地结合组织中神经细胞上的电压门控钠离子通道同时也更容易从神经细胞上解离。这可能是由于坐骨神经干是一个相对复杂的组织，由胶质细胞、组织液和多种具有不同生理特性的神经纤维构成，构成神经纤维的神经细胞也各不相同，药物作用于坐骨神经干时要经过一个浸润的过程才能到达目标细胞进而调制细胞膜上的电压门控钠离子通道，龙血素B在组织中的具体作用机制并不清楚，需要进一步的研究。

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