油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响

邢媛媛，李红磊，李大彪，胡红莲，张兴夫，高 民,*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院动物营养研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响

邢媛媛1，李红磊1，李大彪1，胡红莲2，张兴夫2，高 民1,2*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院动物营养研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

本试验旨在探讨油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为试验材料，经纯化培养后，培养基中添加0（对照）、50、100、200、400 µmol/L油酸，继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞活力；利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量；采用实时定量PCR法检测乳脂肪合成相关基因的表达。结果表明：油酸浓度为200、400 µmol/L时，BMECs相对增殖率显著低于对照组与其他试验组（P＜0.05）；添加100、200 µmol/L的油酸促进了胞内甘油三酯的合成（P＜0.05）；添加油酸上调了二酰甘油酰基转移酶（DGAT）基因表达量，50 µmol/L的油酸显著上调了乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARGγ）基因表达量（P＜0.05），100～400 µmol/L的油酸显著抑制了硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3）、固醇调节原件结合蛋白1（SREBP-1）基因表达量。综上所述，50～100 µmol/L的油酸对BMECs乳脂肪合成具有较好的促进效果。

奶牛乳腺上皮细胞；油酸；细胞活力；甘油三酯；乳脂肪合成相关基因

油酸作为重要的乳成分合成前体物，能为动物机体提供能量，还能减少血液中胆固醇和甘油三脂的含量、降低血脂、防止高血压、提高机体免疫力等[1]。关于泌乳机理的体外研究主要以奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为模型，从基因组学和蛋白质组学揭示油酸对乳脂肪和乳蛋白合成的调控机理。崔瑞莲[2]研究发现，添加200 μmol/L和400 μmol/L油酸会抑制细胞增殖，0～100 μmol/L油酸会促进胞内甘油三酯合成。Kadegowda等[3]研究指出，油酸能直接影响BMECs中脂肪生成基因的表达。乳脂肪合成的调控是由一个复杂的基因网络进行的。在这一基因网络中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARGγ)和固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）是调节乳脂合成相关基因重要的转录调控因子和核受体，在细胞调控因子通路中处于枢纽位置，而且PPARG可能调控SREBP1的表达。而脂肪酸从头合成基因乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FASN），脂肪酸摄取转运基因脂蛋白脂酶（LPL）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3），脂肪酸合成过程中的硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）等诸多基因围绕这两个重要调控因子，形成一个调控网络，在基因转录水平调控乳脂肪的合成[4]。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM/F12、无脂肪酸的牛血清白蛋白、氢化可的松、胰岛素转铁蛋白溶液均购自Gibco公司；无水乙醇、表皮生长因子、催乳素、胶原酶Ⅱ、双抗、胰蛋白酶/EDTA、 MTT和油酸均购自Sigma公司；磷酸缓冲液 （PBS）溶液和胎牛血清购自HyClone公司；基质胶（Matrigel）和细胞回收液均购自Corning公司；总RNA提取试剂盒（RNA isoplus）、RTPCR试剂盒（prime scriptTMRT reagent kit）、Real-Time PCR试剂盒均购自 TaKaRa 公司；TAG试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验设计 采用单因子完全随机试验设计。选取健康的中国荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞进行体外培养，经纯化后，收集第2代的乳腺上皮细胞，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养至细胞长满60%～70%时，添加含有0（对照）、50、100、200、400 μmol/L油酸的诱导培养基，诱导培养基为添加2 mmol/L谷氨酰胺、1 ng/mL氢化可得松及5 μg/mL胰岛素转铁蛋白溶液的DMEM/F12培养基。培养24 h后收集细胞，提取总RNA，测定浓度，制备RT-qPCR反应液，应用RT-qPCR方法，检测乳脂合成相关基因[乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FASN）、二酰甘油酰基转移酶（DGAT）、SCD]、乳脂合成相关转运调控因子[FABP3、PPARGγ、固醇调节原件结合蛋白1（SREBP-1）]，各基因表达量用2-△△Ct值表示。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 乳腺上皮细胞培养的获取与纯化 选取处于泌乳高峰期体况良好的荷斯坦奶牛进行试验，从奶牛乳腺组织取样，剪取腺泡丰富的乳腺组织约50 g，利用胶原酶Ⅱ消化法获得原代乳腺上皮细胞。待原代细胞长满培养瓶底的80%左右时，利用乳腺上皮细胞和成纤维上皮细胞对胰蛋白酶的敏感度不同来纯化乳腺上皮细胞并传代。传至第1代冻存备用。

1.3.2 油酸的配制 将1 g的油酸溶到无水乙醇中，配制成1 mol/L的储液，-80℃冰箱保存。再按照一定比例将油酸添加到诱导培养液中。为了防止油酸在液体中析出，将油酸单独添加到牛血清白蛋白中，诱导培养液中牛血清白蛋白的浓度为1 g/L。

1.3.3 BMECs细胞活力的检测 用MTT法检测BMECs的增殖能力。将BMECs悬浮液接种于96孔培养板中，每孔接种密度是1×104个/200 μL，将培养板放于培养箱中培养。24 h后添加含不同浓度油酸的诱导培养液，继续培养48 h，每个试验组均设7个重复。培养结束前4 h吸出培养液，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，4 h后弃去MTT，每孔再加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，490 nm波长下检测各孔的吸光光度值（OD490）。细胞相对增殖率RGR（Relative Growth Rate）=试验组OD490/对照组OD490。

1.3.4 BMECs内TAG含量的测定 将BMECs接种于25 cm2培养瓶中，每瓶接种量3×105个/5mL。培养24 h后，分别添加含不同油酸浓度的诱导培养液，继续培养48 h。用0.25%胰蛋白酶/EDTA混合液消化并收集细胞沉淀，用PBS清洗沉淀2遍，再将细胞转移至1.5 mL离心管中，每管加入200 μL的PBS后将BMECs超声破碎，按照甘油三酯试剂盒给出的方法检测BMECs胞内TAG的含量。

1.3.5 BMECs中乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达量的测定 将第2代细胞悬浮液接种于75 cm2培养瓶中，每瓶10 mL含有8×105个细胞，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，待细胞生长至80%汇合后，分别添加含不同浓度油酸的DMEM/F12诱导培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h，使用胰蛋白酶/EDTA消化细胞，将细胞悬液128×g离心10 min，弃去上清液，用PBS清洗，细胞总RNA的提取采用试剂盒按说明书进行，用分光光度计测定提取的总RNA的浓度及OD260/ OD280，反转录PCR按照试剂盒说明进行操作。本试验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，引物序列及参数见表1。试验每组设3个重复。

表1 引物序列及参数

1.4 统计分析 试验数据采用Excel 2007进行计算和整理，RT-qPCR试验结果采用2－△△Ct法进行相对定量分析。利用SAS 9.0软件的One-Way ANOVA程序对数据进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan's法，以P＜0.05作为差异显著的判别标准。

2 结 果

2.1 油酸对BMECs增殖的影响 由表2可知，其中50 μmol/L油酸组BMECs的相对增殖率（RGR）高于对照组趋势（P＞0.05）。200、400 μmol/L油酸组BMECs的相对增殖率显著低于对照组（P＜0.05）。

2.2 油酸对BMECs内乳脂合成的影响 由表3可以看出，添加不同浓度油酸均会促进BMECs胞内TAG的合成，其中100、200 μmol/L油酸处理组BMECs胞内TAG合成量显著高于对照组及其他处理组（P＜0.05）。

2.3 油酸对BMECs乳脂合成相关基因表达的影响 由表4可知，添加50 μmol/L油酸ACC基因的表达量显著高于对照组，而添加100 μmol/L和400 μmol/L的油酸ACC的表达量显著低于对照组（P＜0.05）。油酸浓度为200 μmol/L时，FASN的相对表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，油酸处理组上调了DGAT2的基因表达水平，其中200 μmol/L的油酸处理组DGAT2的基因表达量显著高于对照组（P＜0.05）。油酸处理组SCD和FABP3基因表达量显著低于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，100～400 μmol/L油酸显著抑制SREBF1基因的表达，并呈现剂量效应（P＜0.05）。50 μmol/L的油酸处理组，PPARG的基因表达量显著高于对照组（P＜0.05），而100、200、400 μmol/L油酸处理组，PPARG的基因表达量则显著低于对照组（P＜0.05）。

表 2 添加不同浓度油酸对奶牛乳腺上皮细胞增殖能力的影响

表 3 添加不同浓度油酸对奶牛乳腺上皮细胞内TAG合成的影响

表 4 添加油酸对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成相关基因表达量的影响

3 讨 论

3.1 油酸对BMECs增殖的影响 MTT法检测细胞增殖能力的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能把MTT还原为不溶性的蓝紫色的结晶甲瓒，并沉积在细胞中，细胞内的结晶数量与细胞增殖能力呈正比。BMECs的活力是乳脂乳蛋白合成的前提。本研究发现，随着油酸浓度的增加，BMECs的增殖被显著抑制。孙晓菊等[5]研究发现，高浓度的油酸会抑制BMECs的增殖。崔瑞莲等[2]研究指出，200、400 μmol/L的油酸会显著抑制BMECs的增殖。冯小宝[6]研究表明，0～100 nmol/L的油酸能够促进BMECs的增殖，BMECs对油酸的吸收利用需要蛋白介导的膜转运过程。本试验与前人研究结果一致，BMECs的增殖能力与油酸的添加浓度存在剂量依赖关系。

3.2 油酸对BMECs甘油三酯合成及乳脂肪合成相关基因表达的影响 乳脂肪是牛奶的风味物质，其含量影响着牛奶的品质。BMECs胞内甘油三酯的合成量是评定油酸能否促进乳脂肪合成的重要指标。有研究发现，在细胞增殖不受抑制的情况下，油酸能促进BMECs胞内TAG的合成[2]。Yonezawa等[7]研究表明，向BMECs培养液中添加不饱和脂肪酸，均能促进细胞内TAG的沉积。在本试验条件下，不同浓度的油酸处理组均会促进BMECs内TAG的合成，其中100、200 μmol/L的油酸处理组TAG合成量显著高于对照组，这与前人的研究结果一致。

乳脂肪作为牛奶中重要的营养物质，主要包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸在维护人体健康方面扮演着重要的角色。前人针对油酸对乳脂肪合成的影响及其调控机理也开展了一些研究工作。ACC和FASN是脂肪酸从头合成的关键酶，Kadegowda等[3]研究发现，添加长链脂肪酸会抑制ACC和FASN的基因表达量。DGAT2是TAG合成的重要基因，在TAG合成过程中必不可少，DGAT2基因沉默或缺失会导致TAG合成效率的降低[8-9]。研究表明，在BMECs培养液中添加一定量的油酸会抑制ACC基因的表达，促进DGAT2基因的表达[2,5]。本试验发现，高浓度的油酸会抑制ACC基因的表达，上调DGAT2基因的表达，DGAT2基因的高表达可能是促进胞内TAG沉积的主要原因。

在乳腺组织中SCD 是单不饱和脂肪酸合成的关键酶，SCD可以在碳链的Δ9 位置引入双键，使饱和脂肪酸变成不饱和脂肪酸[10]。FABP3是一种结合长链脂肪酸的胞质蛋白质，在奶牛乳腺组织中参与脂肪酸的摄取转运。Bionaz等[9]研究发现，FABP3主要是为SCD 提供脂肪酸进行乳脂肪的从头合成。关于不饱和脂肪酸对SCD和FABP3表达的影响与前人研究结果不一致。有研究表明，体外培养BMECs添加不饱和脂肪酸会降低BMECs中SCD和FABP3的mRNA转录水平[2,5,11]。而Sheng等[12]研究发现，在BMECs培养液中添加不同配比不饱和脂肪酸会上调SCD和FABP3的表达。本研究表明，添加油酸处理组会降低SCD和FABP3的表达量。

SREBF-1在反刍动物乳脂合成过程中起到关键调控作用，调控乳脂合成相关基因mRNA转录[13-14]。不饱和脂肪酸会抑制SREBF-1的表达[15-16]。过氧化物酶激活受体（PPAR）是配体激活核受体亚家族，其中PPARG是调控乳脂肪合成的关键核受体，脂肪酸代谢方面具有重要的转录调控作用[9]。孙晓菊[5]研究发现，50 μmol/LL的油酸上调了PPARG的表达量，高浓度的油酸降低了PPARG的表达量。还有研究指出不饱和脂肪酸对 PPARG 基因表达量有下调的趋势[3]。Kadegowda等[3]研究指出，SREBF1的表达可能受到PPARG的调控，PPARG促效剂不但促进其靶基因ACC和FASN的表达，也上调了SREBF1的基因表达量。本研究得出，添加100 ～

400 μmol/L的油酸显著抑制了SREBF-1 mRNA的转录水平，进而抑制其靶基因ACC、FASN和SCD的表达；添加50 μmol/L的油酸上调了PPARG基因的表达，添加100～400 μmol/L的油酸抑制了PPARG的表达，其原因可能是添加较高浓度的油酸对细胞造成损伤，使细胞膜表面受体及转运基因FABP3表达受阻，阻碍了胞外信号向细胞核的转导，从而抑制了PPARG的表达。添加100～400 μmol/L油酸，SREBF1和PPARG的表达同时被抑制，可能是ACC、FABP3和SCD的表达量降低的主要原因。

乳脂肪和乳蛋白质作为牛奶中重要的营养物质，是衡量牛奶品质的重要指标。目前我国生鲜乳的乳蛋白和乳脂肪的含量普遍低于发达国家[5]。深入研究乳成分前体物对泌乳过程的影响并揭示其调控机理对提高牛奶品质有重要意义。根据前人研究结果，本试验以BMECs为试验模型，设计了不同的添加剂量，进一步研究验证不同浓度的油酸对细胞活力、甘油三酯合成量和乳脂肪合成及相关基因mRNA转录水平的影响，从而筛选油酸的最佳浓度，这在国内外尚未见系统报道，为研究油酸对乳脂肪及乳蛋白合成的调控机理提供了新的理论依据。

4 小 结

本研究表明，由200 μmol/L和400 μmol/L的油酸显著降低了BMECs的增殖能力。添加50～100 μmol/L的油酸促进了胞内TAG的合成，上调了DGAT2基因的表达。50 μmol/L的油酸显著上调了ACC和PPARG的表达。综上所述，50～100 μmol/L的油酸对BMECs乳脂肪合成具有较好的促进效果。

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Ef f ects of Oleic Acid on Triglyceride Content and Gene Expressions Involved in Milk Fat Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

XING Yuan-yuan1, LI Hong-lei1, LI Da-biao1, HU Hong-lian2, ZHAG Xing-fu2, GAO Min1,2*

The aim othis study was to determine the eects ooleic acid on triglyceride content and gene expressions involved in milkat synthesis in bovine mammary epithelial cells (BMECs). Mammary epithelial cellsrom Chinese Holstein cows were culture and purication. Dierent concentrations [0(control), 50, 100, 200, 400 µmol/L] ooleic acid were added in culture mediumor a 24 h cultivation. Cell viability was detected by thiazoly blue tetrazolium bramide (MTT); triglyceride (TAG) content was measured by using TAG determination kit; gene expressions involved in milkatsynthesis were measured by real-time quantitative (RT-qPCR). The results showed that 200 µmol/L and 400 µmol/L oleic acid signicantly inhibited the prolieration oBMECs compared with control and other experimental groups (P＜0.05); 100 μmol/L and 200 μmol/L oleic acid signicantly promoted TAG synthesis in BMECs (P＜0.05). SCD, FABP3 and SREBF1 gene expression were signicantly suppressed by addition ooleic acid (P＜0.05), however, DGAT2 gene expression was increased.50 µmol/L oleic acid signicantly increased ACC and PPARGγ gene expression(P＜0.05). In conclusion, 50 to 100 µmol/L oleic acid is an optimal level considering its improvement eects on milkat synthesis.

Bovine mammary epithelial cells; Oleic acid; Cell viability; Triglyceride; Genes related in milkat synthesis

S823.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-056

2016-12-05；

2017-03-27

现代农业（奶牛）产业技术体系建设专项资金（CAR S-37）

邢媛媛（1991-），女，内蒙古人，硕士研究生，从事反刍动物营养生理及瘤胃微生态研究，E-mail:xingyuany uan2014@163.com

* 通讯作者：高民，E-mail: gmyh1588@126.com