金刚藤白藜芦醇的纯化及抗氧化活性研究

唐玉莲，陈迪钊，肖小丽，邹琼宇

(1.中南林业科技大学材料科学与工程学院, 长沙 410004； 2.怀化学院 化学与材料工程学院，湖南 怀化418000)

油脂安全

金刚藤白藜芦醇的纯化及抗氧化活性研究

唐玉莲1，陈迪钊2，肖小丽1，邹琼宇2

(1.中南林业科技大学材料科学与工程学院, 长沙 410004； 2.怀化学院 化学与材料工程学院，湖南 怀化418000)

采用超声波辅助提取金刚藤白藜芦醇，得到粗提物，再利用硅胶柱层析对粗提物进行纯化，然后通过白藜芦醇对油脂抗氧化及对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除效果，研究金刚藤白藜芦醇的抗氧化活性。结果表明：从金刚藤中提取白藜芦醇的得率为2.36%；金刚藤白藜芦醇具有较强的抗油脂氧化和清除自由基的能力，当金刚藤白藜芦醇质量浓度为8 mg/mL时，对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为71.91%和75.14%；提取物经过纯化后，抗氧化活性明显增强。

金刚藤；白藜芦醇；纯化；抗氧化活性

金刚藤是百合科菝葜属植物菝葜(SmilaxchinaL.)的根茎，其性甘酸、平，有祛风利湿、解毒散瘀之功效，民间常用来治疗风湿关节痛、跌打损伤、胃肠炎、痢疾等疾病。金刚藤的主要化学成分包括芪类、黄酮和皂苷类等成分[1]，白藜芦醇为芪类化合物的主要成分之一[2]。已有研究表明白藜芦醇具有抗氧化、清除自由基、降血脂等活性[3]，近年来已有不少学者对中草药中白藜芦醇的体外抗氧化活性进行了研究[4-8]。随着人们对食品安全意识的加强，天然抗氧化剂因其毒性较低而逐渐引起关注，天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂将是今后食品、药品、化妆品行业的发展方向。因此，如何更高效地从天然植物中分离提取抗氧化剂的有效成分，以及研究各类天然抗氧化剂之间的协同增效作用等，已成为天然抗氧化剂研究刻不容缓的问题[9-11]。

为了充分利用怀化民族药用植物资源金刚藤，并结合湖南正清制药集团股份有限公司的生产工艺，尝试利用硅胶柱层析纯化金刚藤白藜芦醇，通过金刚藤白藜芦醇清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力及抗油脂氧化的能力研究其体外抗氧化活性，为进一步研究金刚藤发挥治疗作用的物质基础和开发具有保健功能的天然抗氧化剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金刚藤来自湖南正清制药集团股份有限公司，经公司工程师宋思才鉴定为金刚藤；植物油为湖南省芷江杨家将油业有限公司生产(无添加剂)；白藜芦醇标准品购于中国药品生物制品鉴定所，反相硅胶购于青岛海洋化工厂，其余试剂均为分析纯，水为实验室自制三重蒸馏水。

UV-1750型紫外可见分光光度计，LC-15C型高效液相色谱仪，RE-52型旋转蒸发仪， GZX-9070型数显鼓风干燥箱， FW100型粉碎机，AL204型电子分析天平，KQ-100DB型超声波清洗机。

1.2 实验方法

1.2.1 金刚藤白藜芦醇的提取

金刚藤干燥后用粉碎机粉碎过50目筛，置于干燥器中备用。参照文献[12]方法，准确称取金刚藤粉末2.000 0 g，用20倍体积70%甲醇超声提取40 min，抽滤，将残渣继续用70%甲醇提取两次，合并滤液并旋转蒸干，浓缩液用甲醇溶解并定容至10 mL，得白藜芦醇粗提液(以下简称粗提液)，备用。

1.2.2 金刚藤白藜芦醇的纯化及含量测定

将粗提液在旋转蒸发仪上蒸干，然后用50 mL石油醚-乙酸乙酯(体积比9∶1)[13]溶解。过80～120目的硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(体积比 9∶1)以1 mL/min流速洗脱，得到纯度较高的白藜芦醇纯化液(以下简称纯化液)，备用。

精密称取白藜芦醇标准品10.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得母液。分别吸取母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，配成质量浓度分别为20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL的标准品溶液。

分别吸取标准品溶液、粗提液及纯化液20 μL注入高效液相色谱系统，检测相应的色谱峰面积并计算白藜芦醇的含量。色谱条件：WondaSilTMC18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为水-甲醇(体积比4∶6)；检测波长303 nm；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；柱温为室温。

1.2.3 金刚藤白藜芦醇抗氧化活性测定

1.2.3.1 清除羟基自由基[14]能力

参照Fenton反应的方法建立羟基自由基产生体系模型[15]。反应体系中含H2O2(8.8 mmol/L)、FeSO4(9.0 mmol/L)、水杨酸-乙醇(9.0 mmol/L)各2.00 mL，以及2.00 mL不同质量浓度的白藜芦醇溶液，最后加H2O22.00 mL启动反应，并用蒸馏水补充至25.00 mL，37℃水浴恒温反应1 h，以蒸馏水为空白对照于510 nm波长下测吸光值，按下式计算羟基自由基清除率。

羟基自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ao)] ×100%

式中：Ai、Aj和Ao分别为某质量浓度白藜芦醇、不加H2O2时该质量浓度的本底及空白对照的吸光值。

1.2.3.2 清除超氧阴离子自由基能力

参照文献[7,16]方法，取4.50 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl(pH=8.2)缓冲液，加入不同质量浓度的白藜芦醇溶液1.00 mL及3.20 mL蒸馏水，于25℃水浴中恒温20 min后，加入0.30 mL 3 mol/L的邻苯三酚溶液，混合均匀，在325 nm波长处，每隔1 min测定反应体系的吸光值，共反应4 min；以吸光值A对反应时间t作线性关系图，计算加样后邻苯三酚的自氧化速率△As；以10 mmol/L HCl代替邻苯三酚作为对照，计算对照品溶液的自氧化速率△Ao，按下式计算超氧阴离子自由基清除率。

超氧阴离子自由基清除率=(1-△As/△Ao)×

100%

1.2.3.3 抑制植物油氧化能力

精确量取含有25.00 mg白藜芦醇的甲醇溶液，加入到25.00 g植物油的碘量瓶中，充分搅拌配成含白藜芦醇1.00 mg/g的母液，分别取0.00、6.00、9.00、12.00、15.00 g母液加入到盛有50.00 g植物油的锥形瓶中，即配成含白藜芦醇0、120、180、240、300 mg/kg的样品油试样，并置于60℃的恒温箱中强化保存。每隔24 h测定1次过氧化值，以不加白藜芦醇的样品为空白，每个样品平行测定3次，取平均值。参照文献[17]测量样品溶液的过氧化值。

2 结果与讨论

2.1 纯化后白藜芦醇的得率

以白藜芦醇标准品溶液的质量浓度对峰面积进行线性拟合，得回归方程为Y=145 430.15X+372 576，相关系数r=0.999 0，相对标准偏差为1.95%，表明白藜芦醇在20～100 μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。根据纯化液的峰面积及回归方程计算纯化后白藜芦醇的得率为2.36%。

2.2 金刚藤白藜芦醇的抗氧化活性

2.2.1 对羟基自由基的清除能力(见图1)

由图1可以看出，金刚藤白藜芦醇对羟基自由基具有较强的清除能力，并且随着其质量浓度的增加，清除能力增强。粗提液经纯化后清除能力增强，在质量浓度8 mg/mL时，纯化后白藜芦醇的羟基自由基清除率达到71.91%。

图1 金刚藤白藜芦醇对羟基自由基的清除能力

2.2.2 对超氧阴离子自由基的清除能力(见图2)

图2 金刚藤白藜芦醇对超氧阴离子自由基的清除能力

由图2可以看出，金刚藤白藜芦醇对超氧阴离子自由基具有较强的清除能力，且随着其质量浓度的增加，清除能力增强。粗提液经纯化后，对超氧阴离子自由基的清除率明显增强。在质量浓度8 mg/mL时，纯化后白藜芦醇的超氧阴离子自由基清除率达到75.14%。

2.2.3 对植物油的抗氧化效果

不同添加量金刚藤白藜芦醇对植物油的抗氧化作用如图3所示，不同抗氧化剂对植物油的抗氧化作用如图4所示。

图3 不同添加量金刚藤白藜芦醇对植物油的抗氧化作用

图4 不同抗氧化剂对植物油的抗氧化作用

由图3可知，添加金刚藤白藜芦醇后，植物油的过氧化值均低于空白对照，说明金刚藤白藜芦醇对植物油具有抗氧化作用，当添加量为240 mg/kg时，白藜芦醇对植物油的抗氧化活性最强，作为实验添加量。由图4可知，金刚藤白藜芦醇经过纯化后，对植物油的抗氧化能力相比粗提液大大提高，与VE相当，且略高于VE。

3 结 论

采用超声波辅助提取金刚藤白藜芦醇，再经硅胶柱层析纯化，考察白藜芦醇对羟基自由基、超氧阴离子自由基清除作用。结果表明：经过纯化后，金刚藤白藜芦醇对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力明显增强，对油脂抗氧化能力大大增强。由此可知，金刚藤白藜芦醇是一种很好的天然抗氧化剂。

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Purification of resveratrol fromSmilaxchinaL. and its antioxidant activity

TANG Yulian1, CHEN Dizhao2, XIAO Xiaoli1, ZOU Qiongyu2

(1.School of Materials Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2.School of Chemistry and Materials Engineering,Huaihua University, Huaihua 418000, Hunan, China)

The crude resveratrol extract was obtained fromSmilaxchinaL. by ultrasound-assisted extraction and it was purified by silica gel column chromatography. The antioxidant activity of esveratrol was evaluated by researching the antioxidant effect of resveratrol on oil and the scavenging effect of resveratrol on superoxide anion radical and hydroxyl radical. The results showed that the yield of resveratrol extracted fromSmilaxchinaL. was 2.36%. And resveratrol fromSmilaxchinaL. had stronger antioxidant effect on oil and free radical-scavenging capacity. When the mass concentration of resveratrol fromSmilaxchinaL. was 8 mg/mL, the scavenging rates on hydroxyl radical and superoxide anion radical were 71.91% and 75.14% respectively. Moreover, the antioxidant activity of the extract improved apparently after purification.

SmilaxchinaL.; resveratrol; purification; antioxidant activity

2016-09-27；

2017-03-02

湖南省高校产业化培养项目(11CY013)

唐玉莲(1982)，女，讲师，硕士，研究方向为中药现代化(E-mail)tangyulian0824@163.com。

陈迪钊，教授(E-mail)dzchen2002@163.com。

TS202.3; Q946.91

A

1003-7969(2017)06-0086-03