萝卜籽粕中蛋白质的提取及抗氧化活性研究

赵功玲，梁新红，郭延成，孔 瑾

(河南科技学院 食品学院，河南 新乡453003)

油料蛋白

萝卜籽粕中蛋白质的提取及抗氧化活性研究

赵功玲，梁新红，郭延成，孔 瑾

(河南科技学院 食品学院，河南 新乡453003)

萝卜籽粕；蛋白质；提取；抗氧化性能；相对分子质量

萝卜籽具有多种药理活性，可下气化痰、消食除胀，还具有去雀斑、改善肤色，防止皱纹产生等美容功能[1]。萝卜籽的含油量很高，最高可达45%[2]。现代研究表明，萝卜籽油中含多种不饱和脂肪酸[3]及大量的异硫氰酸酯(其中60%是莱菔素)[4]，具有很强的抗癌、抗氧化、抑菌、调节血脂代谢等作用[5-7]，因此萝卜籽是生产食用油的优良原料。

随着萝卜籽油的开发生产，产生了大量萝卜籽粕。传统上这些副产物只作为肥料使用，附加值很低。有研究表明，萝卜籽中的蛋白质品质优良，且具有抗真菌的作用，有很好的应用价值及前景[8]。在我国的植物蛋白资源中，大豆蛋白的营养价值高且性能良好，在我国食品加工中有广泛应用，而其他种类的蛋白质却应用很少。经初步测定，萝卜籽粕中蛋白质含量将近30%，有很好的开发利用价值。

本研究拟采用正交试验优化萝卜籽粕中蛋白质的提取工艺，并研究提取的蛋白质的抗氧化活性及亚基组成，为萝卜籽粕中蛋白质的工业化生产和进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

萝卜籽粕：亚临界低温萃取油脂后的萝卜籽残渣(水分含量 0.82%，油脂含量1.77%)，高速粉碎机粉碎，过80目筛，避光低温保存备用。

盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

高速粉碎机；恒温磁力搅拌器；320P-063-Star 型pH 计，美国奥立龙公司；LGJ-10 冷冻干燥机；T6紫外-可见分光光度计；TDL-5-A 低速大容量离心机；JS680D凝胶成像仪。

1.2 试验方法

1.2.1 萝卜籽粕中蛋白质提取工艺

1.2.1.1 工艺路线

萝卜籽粕粉加水→调pH至碱性→一定温度下恒温振荡一段时间 →离心(4 500 r/min，10 min)→得到上清液→加盐酸调pH→沉淀→水洗→离心→冷冻干燥→蛋白质。

1.2.1.2 工艺参数优化

取10 g 萝卜籽粕，选取料液比、碱溶pH、提取温度、提取时间、酸沉pH为因素，以蛋白质提取率(见公式(1))为评价指标，进行单因素试验及L9(34)正交试验，确定最佳蛋白质提取条件。

1.2.2 蛋白质含量的测定

采用GB 5009.5—2010方法(凯氏定氮法)测定蛋白质含量。

1.2.3 体外抗氧化活性测定

1.2.3.1 清除DPPH·活性测定

取不同质量浓度的蛋白质溶液3.0 mL于试管中，分别加入0.6 mL的0.4 mmol/L DPPH溶液，再加6.0 mL蒸馏水。混匀反应体系，置于黑暗中30 min，于517 nm下测定吸光值A1；将不同质量浓度的蛋白质溶液与无水乙醇等体积混合于试管中，摇匀，置于黑暗处30 min，于517 nm下测定吸光值A2；再将DPPH与蒸馏水等体积混合，测定517 nm下的吸光值A0；以蒸馏水和无水乙醇的等体积混合溶液作空白，用于仪器调零，每个试验做3次平行。按公式(2)计算蛋白质对DDPH·的清除率。

清除率=(A0-A1+A2)/A0×100%

(2)

清除率=(A1-A0)/A0×100%

(3)

1.2.3.3 清除H2O2活性测定

取不同质量浓度蛋白质溶液2.0 mL于试管中, 分别加入4.8 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mmol/L，pH 7.4)和1.2 mL 40 mmol/L H2O2溶液，混匀，于室温下放置10 min，230 nm下测定吸光值A1。以蒸馏水替代样品做相同试验，测定吸光值A0。以蒸馏水替代H2O2和样品做相同试验，测定吸光值A2。每个试验做3次平行。按公式(4)计算蛋白质对H2O2的清除率。

清除率=(A0-A1+A2)/A0×100%

(4)

1.2.3.4 清除·OH活性测定

在反应体系中依次加入1 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液，1.5 mL 150 mmol/L的PBS缓冲液(pH 7.5)，充分混匀后，再加入1 mL 0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液，立即摇匀，再向反应体系中加入不同质量浓度的蛋白质溶液1 mL，混匀后，加入1 mL 0.01%的H2O2溶液，混匀后37℃反应30 min。536 nm下测定吸光值A2。以等体积蒸馏水代替蛋白质样品做相同试验，测定吸光值A1。以等体积蒸馏水代替蛋白质和H2O2溶液做相同试验，测定吸光度A0。重复上述试验3次，按公式(5)计算蛋白质对·OH的清除率。

清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

(5)

1.2.4 SDS-PAGE分离和相对分子质量测定

[11-12]采用SDS-PAGE方法分离提取的蛋白质并测定其相对分子质量。

1.2.5 数据分析

试验结果采用SPSS17.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质提取单因素试验

2.1.1 料液比对蛋白质提取率的影响

在碱溶pH 10，提取温度60℃，提取时间120 min，酸沉pH 4.5，料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的条件下提取蛋白质，结果见图1。

图1 料液比对蛋白质提取率的影响

由图1可以看出，随料液比的增大，蛋白质提取率随之增大，但料液比为1∶50与1∶60时，蛋白质提取率相差不大。考虑到节约成本，选择料液比为1∶50 较适合。

2.1.2 碱溶pH对蛋白质提取率的影响

在料液比1∶50，提取温度60℃，提取时间 120 min，酸沉 pH 4.5，碱溶pH分别为 8、9、10、11、12的条件下提取蛋白质，结果见图2。

图2 碱溶pH对蛋白质提取率的影响

由图2可以看出，当碱溶pH 8～10，蛋白质提取率逐渐升高，而后随碱溶pH的升高，蛋白质提取率逐渐降低。显然，碱溶pH 10时蛋白质提取率最高。所以选择碱溶pH为10。

2.1.3 提取温度对蛋白质提取率的影响

在料液比1∶50，碱溶pH 10，提取时间120 min，酸沉pH 4.5，提取温度分别为45、50、55、60、65、70℃的条件下提取蛋白质，结果见图3。

图3 提取温度对蛋白质提取率的影响

由图3可以看出，随提取温度的升高，蛋白质提取率逐渐升高而后稍降低，60℃时蛋白质提取率最高，达78.8%。当提取温度超过60℃，提取率略有下降的原因可能与高温导致萝卜籽粕中蛋白质的变性有关。所以选择提取温度为60℃。

2.1.4 提取时间对蛋白质提取率的影响

在料液比1∶50，碱溶pH 10，提取温度60℃，酸沉pH 4.5，提取时间分别为30、60、90、120、150 min的条件下提取蛋白质，结果见图4。

图4 提取时间对蛋白质提取率的影响

由图4可以看出，随提取时间从30 min延长至120 min，蛋白质提取率逐渐升高，提取时间超过 120 min，蛋白质提取率稍有降低。所以选择提取时间为120 min。

2.1.5 酸沉pH对蛋白质提取率的影响

在料液比1∶50，碱溶pH 10，提取温度60℃，提取时间120 min，酸沉pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的条件下提取蛋白质，结果见图5。

图5 酸沉pH对蛋白质提取率的影响

由图5可以看出，随着酸沉pH的升高，蛋白质提取率逐渐提高，但酸沉pH超过4.5时，提取率逐渐降低，因此酸沉pH控制在4.5为宜，这说明萝卜籽粕中蛋白质的等电点为4.5，这与大多数植物蛋白质的等电点为4.5～5.5相吻合[13-14]。

2.2 蛋白质提取正交试验

在酸沉pH 4.5的条件下进行萝卜籽粕中蛋白质提取的正交试验，正交试验设计及结果见表1。由表1可以看出，极差分析得到影响蛋白质提取率的因素由大到小依次是：B>A>D>C，即碱溶pH>料液比>提取时间>提取温度；蛋白质最佳提取条件为A2B2C2D3；由直观分析知，试验号5即A2B2C3D1的蛋白质提取率最高。为了缩短提取时间，提高生产效率，选取A2B2C2D1，即料液比1∶50、碱溶pH 10、提取温度60℃、提取时间90 min作为最佳提取条件。在最佳提取条件下进行4次验证试验，萝卜籽粕中蛋白质提取率可达80.2%，蛋白质纯度为89.5%。

表1 正交试验设计及结果

2.3 蛋白质的抗氧化活性(见图6)

图6 蛋白质对和H2O2的清除能力

2.4 蛋白质的SDS-PAGE分离和相对分子质量

萝卜籽粕中蛋白质样品经SDS-PAGE凝胶分离，由凝胶成像仪扫描，结果见图7。由图7可以看出，蛋白质样品分离成若干条带，当上样量为15 μL时，相比10 μL显示的蛋白质条带清晰度好，分离效果较佳。萝卜籽粕中蛋白质共有5条较清晰的条带，通过与Marker相比，4种亚基分离组分的相对分子质量由小到大分别约为22.0、31.0、43.0、66.2 kDa，1种亚基分离组分的相对分子质量在66.2～97.4 kDa之间。

图7 蛋白质的SDS-PAGE图谱

3 结 论

采用碱溶酸沉法，通过单因素试验及正交试验确定提取萝卜籽粕中蛋白质的最佳工艺条件为料液比1∶50、碱溶pH 10、提取温度60℃、提取时间90 min、酸沉pH 4.5；影响提取率的主要因素是碱溶pH。在最佳提取条件下，萝卜籽粕中蛋白质提取率可达80.2%，蛋白质纯度为89.5%。

萝卜籽粕中蛋白质约有5种亚基分离组分，其中4种亚基分离组分相对分子质量由小到大分别约为22.0、31.0、43.0、66.2 kDa，1种亚基分离组分的相对分子质量在66.2～97.4 kDa之间。

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Extraction and antioxidant activity of protein in radish seed meal

ZHAO Gongling, LIANG Xinhong, GUO Yancheng, KONG Jin

(Department of Food Science, Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003, Henan, China)

radish seed meal; protein; extraction; antioxidant activity; relative molecular weight

2016-10-11;

2017-02-21

河南省基础与前沿技术研究计划项目(152300410096，142300410141)

赵功玲(1968)，女，副教授，研究方向为食品营养与卫生(E-mail)hnzgl@163.com。

孔 瑾，副教授(E-mail)hnzgl@163.com。

TQ936.2; TS229

A

1003-7969(2017)06-0102-05