生、醋莪术对大鼠免疫性肝纤维化及HSC—T6增殖和α—SMA，ProcollagenⅠ表达的影响

张季+宋嬿+王巧晗+李林+季德+顾薇+郝敏+陆兔林+毛春芹

[摘要] 比較生、醋莪术对猪血清所致大鼠免疫性肝纤维化及对活化的肝星状细胞（HSC-T6）增殖和α-SMA，ProcollagenⅠ表达的影响。采用腹腔注射猪血清0.5 mL/只，每周2次，共14周制备大鼠免疫性肝纤维化模型。观察生、醋莪术（0.95，1.90 g·kg^-1）对大鼠血清ALT，AST，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA和肝组织HYP，MDA的表达水平；采用HE染色观察大鼠肝组织病理改变情况，Masson染色和天狼猩红染色观察大鼠肝组织中胶原表达情况；体外培养HSC-T6细胞，MTT法测定不同浓度生、醋莪术含药血清作用12，24，36，48 h对HSC-T6增殖的影响；采用Real-time PCR法检测各组α-SMA和ProcollagenⅠ表达情况。结果显示，给药生、醋莪术后，大鼠血清ALT，AST，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA表达水平均下降，与生莪术组相比，醋莪术组作用效果优于生莪术组；生、醋莪术含药血清各剂量组均能抑制HSC-T6的增殖，呈现一定的量效和时效关系；各给药组作用24 h后，HSC-T6中α-SMA和Procollagen Ⅰ表达水平降低，且醋莪术组降低更显著。生、醋莪术均能不同程度减轻肝纤维化，其抗肝纤维化机制可能与抑制HSC-T6增殖，减少细胞外基质的生成并促进其降解有关。

[关键词] 莪术；醋莪术；肝纤维化；肝星状细胞；Real-time PCR；α-平滑肌肌动蛋白；Procollagen Ⅰ

[Abstract] To compare the effects of Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizomaon immune hepatic fibrosis， proliferation of HSC-T6， and expressions of α-SMA and Procollagen I. The immunological liver fibrosis model was prepared through intraperitoneal injection with porcine serum 0.5 mL in each rat， twice a week， for 14 weeks. Expressions of serum ALT， AST， PC-Ⅲ， IV-C， LN， HA and HYP， MDA in liver tissues were observed after administration of Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma （0.95， 1.90 g · kg^-1）. The pathological changes in liver tissues were observed by HE staining. Masson staining and Sirius red staining were used to observe the expression of collagen in rat liver. HSC-T6 was cultured， and the proliferation of HSC-T6 was determined by MTT assay at different concentrations in 12， 24， 36， 48 h. The expressions of α-SMA and Procollagen I were detected by Real-time PCR. The results showed that expressions of serum ALT， AST， PC-Ⅲ， IV-C， LN and HA in Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma groups （0.95， 1.90 g·kg^-1） were significantly lower than model group；in terms of effect， vinegar-processed Curcumae Rhizoma group was superior to Curcumae Rhizoma group. Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma containing serum could inhibit the proliferation of HSC-T6 in a dose-effect and time-effect manner. Expressions of α-SMA and Procollagen I in HSC-T6 were decreased after 24 h， especially in 20% vinegar-processed Curcumae Rhizoma containing serum group （P<0.01）. Both Curcumae Rhizoma/vinegar-processed Curcumae Rhizoma could reduce immune hepatic fibrosis to varying extent. Their anti-hepatic fibrosis mechanism may be correlated with inhibition of the proliferation of HSC-T6， and reduction of the formation of extracellular matrix and promotion of its degradation.

[Key words] Curcumae Rhizoma；vinegar-processed Curcumae Rhizoma；hepatic fibrosis；hepatic stellate cell；Real-time PCR；α-smooth muscle actin；Procollagen I

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害，其特征在于胶原等细胞外基质的产生和降解失衡，致使细胞外基质过度沉积，使得肝脏的正常结构和功能受到破坏[1]。而活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是纤维化肝脏中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的主要来源。肝脏受到损伤时，HSC增殖活化并转变为肌成纤维细胞，导致细胞外基质过度生成并迁移至肝脏受损区域，引起肝纤维化的发生与发展[2-3]。肝纤维化发生机制复杂，中医解释其病因为肝失疏泄，影响了气的运行和脏腑经络功能，气行则血行，气滞则血瘀，大多数中医学者将肝纤维化归属于中医血瘀证的范畴，在治则上多以活血化瘀为主，兼以益气补虚、养血柔肝或滋补肝肾等法[4]。

莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术C. kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang或温郁金C. wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。后者习称“温莪术”。莪术性温，味苦、辛。具行气破血，消积止痛，活血化瘀的功效，是临床常用的活血化瘀药。已有研究表明，莪术具有抗肝纤维化、抗肿瘤、抗炎的作用[5-8]。在临床上莪术常和其他中药组方用来治疗肝病[9] 。莪术抗肝纤维化既有中医理论的基础，又有临床研究以及实验研究的支持。课题组前期研究证实莪术具有抗复合因素所致大鼠肝纤维化作用，且醋制后增强[10]。肝纤维化研究的动物模型多样，一种模型并不能完全解释莪术抗肝纤维化效应及机制，为进一步研究生、醋莪术抗肝纤维化效应及机制，本实验研究生、醋莪术对猪血清所致大鼠免疫性肝纤维化及其对HSC-T6的调控作用，以期在一定程度上阐释莪术治疗肝纤维化的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

TDZ4B-WS台式低速自动平衡离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SW-CF-1FD超净工作台（苏州净化公司）；SL-16R多功能冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）；NU4950E CO₂恒温培养箱（美国NUAIRE公司）；DFC-259倒置相差显微镜（德国Leica公司）；spectramax M5多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；高速冷冻离心机（Sigma）；紫外分光光度计（Beckman）；恒温金属浴（国产）；CFX384多重实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）。

1.2 试剂

猪血清，平睿生物科技（北京）有限公司（无菌过滤，未经灭活；批号20140904）。甲醛（西陇化工股份有限公司，批号1305082）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒（批号20150819）；天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒（批号20150813）；丙二醛（MDA）测试盒（批号20150813）；羟脯氨酸（HYP）试剂盒（批号20150813）；大鼠层连蛋白/板层素（LN）试剂盒（185110632 R）；大鼠Ⅳ型胶原（IV-C）试剂盒（230511793R）；大鼠Ⅲ型前胶原试剂盒（PC-Ⅲ）（463211053R）；大鼠透明质酸（HA）试剂盒（080411805R）；不完全DMEM（高糖）培养基（含双抗）（KGM 12800-500，江苏凯基生物技术股份有限公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（PBS）（KGY0012，江苏凯基生物技术股份有限公司）；1×PBS（0.01 mol·L^-1，pH 7.4）（KGB5001，江苏凯基生物技术股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号150228）；二甲基亚砜（DMSO）（上海久亿化学试剂有限公司，20150314）；四甲基偶氮唑盐（MTT）（ST316，碧云天生物技术）；75%医用酒精（上海凌峰化学试剂有限公司）；TRIzol Plus RNA Purification Kit （Invitrogen，货号12183-555）；RNase-Free DNase Set（Qiagen，货号79254）；SuperScript^TMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Invitrogen，货号11752-050）。

1.3 试药

莪术药材购自主产地浙江，经南京中医药大学药学院陆兔林教授鉴定为姜科植物温郁金C. wenyujin的干燥根茎。秋水仙碱片（批号20150201），广东彼迪药业有限公司，用蒸馏水制成混悬液。

1.4 动物和细胞

SPF级SD大鼠，雄性，体重180～220 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2013-0006。给予标准光照周期（14 h光照、10 h黑夜），室内温度维持（25±1） ℃，相对湿度维持70%左右，給予普通饲料，自由饮水，适应性饲养1周后进行实验。HSC-T6细胞系购自江苏凯基生物技术股份有限公司（Cat：KG313，Lot：20160225）。

2 方法

2.1 给药样品制备

2.1.1 生、醋莪术提取物的制备 参照2010年版《中国药典》一部莪术炮制项下要求，取莪术，除去杂质，略泡，洗净，蒸软，切厚片，干燥即得生莪术饮片。参照2010年版《中国药典》一部莪术炮制项下要求，取净莪术，照醋煮法（附录ⅡD）煮至透心，取出，稍凉，切厚片，干燥即得醋莪术饮片。每100 kg待炮制品，用米醋20 kg。分别将生莪术、醋莪术饮片用15倍量的90%乙醇加热回流1.5 h，提取2次，药渣加10倍量的水提取1.5 h，合并以上提取液，减压浓缩至生药1.0 g·mL^-1（效应实验），1.5 g·mL^-1（含药血清制备实验）。

2.1.2 含药血清制备 SPF级雄性SD大鼠18只，分成空白组、生莪术组（14.25 g·kg^-1）和醋莪术组（14.25 g·kg^-1），每组6只，空白组给等体积生理盐水，每日1次，连续给药7 d，于末次给药后2 h腹主动脉采血，室温放置1 h后，离心，分离血清，56 ℃灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存，用于后续实验。根据实验需要，用空白组血清稀释成不同浓度。

2.2 动物分组及免疫性肝纤维化模型建立

2.2.1 大鼠免疫性肝纤维化模型建立及给药 根据实验室前期研究确定给药剂量，将大鼠分为正常对照组、模型组、阳性药组（秋水仙碱0.2 mg·kg^-1）、生莪术低、高剂量组（0.95，1.90 g·kg^-1）、醋莪术低、高剂量组（0.95，1.90 g·kg^-1），除正常对照组外，其余各组大鼠腹腔注射猪血清0.5 mL，每周2次，至第14周结束，病理组织学检查造模情况。于造模第7周开始，各给药组分别灌服相应的受试药物，正常组、模型组灌服等量生理盐水，每天1次，连续9周。

2.2.2 标本采集 末次给药后所有大鼠禁食不禁水12 h，称重，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL·kg^-1）麻醉，腹主动脉采血，室温静置1 h后，3 000 r·min^-1，离心5 min，取上清，-20 ℃保存，用于检测ALT，AST，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA的水平。分离肝脏，生理盐水清洗，取下肝右叶滤纸吸干、称重，制备10%肝组织匀浆，用于HYP，MDA的测定。取肝左叶同一部位肝组织约1 cm³大小，固定于10%甲醛溶液，用于肝组织病理切片检查。

2.2.3 指标观察 观察动物的一般状态，包括毛发光泽度、活动情况、精神状态等；肝脏形态学观察：包括外形、色泽、质地等；检测血清肝功能指标ALT，AST的水平；血清肝纤维化指标PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA；肝组织HYP，MDA的水平。各指标测定按照试剂盒说明进行。HE染色观察肝脏病理学改变，Masson染色和天狼猩红染色观察肝纤维化程度。

2.3 生、醋莪术含药血清对HSC-T6增殖的影响

将HSC-T6细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养液，37 ℃，5%CO₂恒温培养箱中培养。隔天于倒置显微镜下观察细胞形态，必要时换液，待细胞贴壁生长至80%左右时传代，传代3～4次后取对数生长期的细胞用于实验。

2.3.1 给药浓度的确定 取处于对数生长期的HSC-T6细胞，以2×10⁴个/mL的浓度接种于96孔板中，置恒温培养箱中培养。细胞贴壁生长后，加入100 μL不同浓度的含药血清（空白血清组，1%，2%，5%，8%，10%，12%，15%，20%含药血清组），并用不完全培养液设置调零组，每组设置6个复孔，于恒温箱中培养24 h。每孔加入5 g·L^-1的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，离心，吸出液体，每孔加入150 μL的DMSO，振荡5 min，用酶标仪在490 nm波长处检测各孔A。根据不同给药浓度的抑制率，绘出浓度-抑制率曲线。

2.3.2 各给药组对HSC-T6细胞增殖的影响 根据上述实验确定合适的给药浓度为5%，10%，15%，20%含药血清，细胞分为空白血清对照组，5%，10%，15%，20%生莪术含药血清组、醋莪术含药血清组，常规培养，种板，待细胞贴壁生长后，弃去原培养液，加入100 μL不同浓度的含药血清，并用不完全培养液设置调零组，每组设置6个复孔，于恒温箱中培养12，24，36，48 h。每孔加入5 g·L^-1的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，离心，吸出液体，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5 min，用酶标仪在490 nm波长处检测各孔A，计算不同给药组的抑制率。

2.4 Real-time PCR法检测α-SMA 和Procollagen Ⅰ mRNA的表达

细胞分为空白血清对照组（Control）、5%（S1）、10%（S2）、20%（S3）生莪术含药血清组、5%（C1）、10%（C2）、20%（C3）醋莪术含药血清组，接种于6孔板中，培养以及给药方法同2.3.2项。用TRIzol提取细胞中总RNA。用核酸蛋白测定仪测定RNA提取细的含量和纯度。将总RNA用RNase-Free Water稀释至100 mg·L^-1，作为逆转录模板进行逆转录。扩增条件为95 ℃，1 min；共反应40个循环（95 ℃15 s，59 ℃25 s，收集荧光）熔点曲线分析：55～95 ℃，引物序列见表1。

2.5 统计学处理

采用Excel 2010软件进行数据整理，通过SPSS 16.0软件进行方差分析，数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

造模过程中正常组大鼠一般情况良好，精神状态好，动作敏捷，体重增加较快，毛质光滑，无死亡。模型组大鼠体重增长缓慢，毛发偏黄、光泽度差。其余各组大鼠均有不同程度的精神萎靡，动作迟钝现象，尤以醋莪术高剂量组大鼠状态较佳。

3.2 对免疫性肝纤维化大鼠血清ALT，AST的影响

与正常组相比，大鼠经腹腔注射猪血清后，模型组血清中ALT，AST水平显著升高（P<0.01），经生、醋莪术给药后均不同程度降低（P<0.01，P<0.05），但效果均弱于等剂量醋莪术组（P<0.01，P<0.05），见表2。

3.3 对免疫性肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标的影响

与正常组相比，大鼠经腹腔注射猪血清后，模型组血清中PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA水平显著升高（P<0.01），经生、醋莪术给药后均不同程度降低（P<0.01，P<0.05），但醋莪術组效果更显著（P<0.05），见表2。

3.4 对免疫性肝纤维化大鼠肝组织HYP，MDA水平的影响

与正常组相比，大鼠经腹腔注射猪血清后，模型组血清中HYP，MDA水平显著升高（P<0.01），说明模型成功。经生、醋莪术给药后不同程度降低（P<0.01，P<0.05），醋莪术高剂量组改善程度更显著，且优于生莪术组（P<0.01，P<0.05），见表3。

3.5 各组大鼠肝组织病理学变化观察

HE染色结果显示：空白组大鼠肝组织结构正常，汇管区无扩大，肝小叶结构完整，无假小叶生成，未见明显炎细胞浸润；模型组大鼠肝组织正常结构被破坏，肝细胞水肿，脂肪变性，淋巴细胞浸润，见点状坏死，纤维间隔进一步伸入并分割肝小叶，形成假小叶；与模型组比较，各给药组大鼠肝组织病理改变均有所改善，以秋水仙碱和醋莪术高剂量组肝组织病变程度最轻，见图1。

Masson染色结果显示：空白组大鼠肝组织镜下结构正常，胶原纤维仅见于汇管区及中央静脉管壁；模型组胶原增生明显，大量纤维组织向小叶内伸展，分割包绕肝组织，形成假小叶；各给药组大鼠肝组织胶原沉积均有所改善，汇管区胶原有所减少，以秋水仙碱和醋莪术高剂量组肝纤维化改善程度最明显，见图2。

天狼猩红染色结果显示：正常组大鼠肝脏Ⅰ型胶原较少，为红色；模型组大鼠肝脏Ⅰ型胶原显著增多，变粗、为红色，可见大量红色胶原纤维穿插于肝小叶内，破坏了肝小叶的正常结构。各组给药治疗后有一定的改善，以阳性药秋水仙碱组、醋莪术高剂量组改善最明显，胶原显著减少，仅在中央静脉周围有少量胶原，见图3。

3.6 含药血清给药浓度的确定

当含药血清浓度低于12%时，抑制率与血清浓度曲线呈线性增长，当含药血清浓度高于12%时，抑制率增长缓慢。根据不同浓度与抑制率的实验选出合适的浓度用于后续实验（5%，10%，15%，20%），见图4。

3.7 不同给药浓度对HSC-T6增殖的影响

生、醋莪术含药血清给药12 h，生、醋组相比没有差异；给药24 h，在5%，10%，20%时，醋莪术的抑制率高于生莪术，且有显著差异（P<0.01，P<0.05）。给药36 h，在15%时，醋莪术的抑制率高于生莪术，且有显著差异（P<0.05）；给药48 h，在5%，10%，20%时，醋莪术的抑制率高于生莪术，且均有显著差异（P<0.05）。总体来说，醋莪术含药血清各剂量组在不同时间段对HSC-T6的抑制率要优于等剂量的生莪术含药血清组，见图5。

3.8 各给药组对α-SMA 和Procollagen Ⅰ mRNA表达的影响

实验结果显示，与空白血清组相比，20%生莪术含药血清组和各剂量的醋莪术组均能抑制α-SMA的表达（P<0.01）。且醋莪术组要优于等剂量的生莪术组（P<0.05）。各给药组Procollagen Ⅰ表达水平均显著下降（P<0.01），以醋莪术高剂量组尤为明显，且与等剂量的生莪术组相比有显著差异（P<0.05），见图6。

4 结论

肝纤维化是指机体对各种有害因素包括病毒、酒精、药物、自身代谢缺陷以及自身免疫性疾病等因素长期作用于肝脏引起肝脏炎症、坏死等组织损伤的一种修复反应，是多种慢性肝病发展至肝硬化或肝癌共有的病理改变，是有可能被逆转的阶段[11]。实验室前期研究显示莪术可以治疗复合因素所致大鼠肝纤维化，因肝纤维化动物模型多样，本实验选择猪血清所致大鼠免疫性的肝纤维化进一步研究，与常见的化学性模型相比，免疫性肝纤维化模型具有损伤小、成模率高、死亡率低等优点[12]，该模型会引起机体免疫调节紊乱，在肝脏汇管区形成免疫复合物，将肝星状细胞转变为肌成纤维细胞，分泌胶原，使得细胞外基质过度沉积同时会引起血管炎和血管周围炎，导致肝细胞坏死及组织损伤，最终进展为肝纤维化，该模型与临床上的慢性肝炎在发病机制上更加接近[13]。而细胞外基质由胶原、多糖、层黏连蛋白等组成，PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA，Hyp作为细胞外基质的组成成分，其水平能够反映肝纤维化的程度，本实验中莪术醋制后能够显著降低PC-Ⅲ，IV-C，LN，HA，Hyp表达水平，且Masson染色和天狼猩红染色结果也显示莪术经醋制后肝组织中胶原表达减少，进一步说明莪术经醋制后能够抑制胶原等ECM的合成并促进其降解，从而发挥治疗肝纤维化的作用。在肝纤维化形成过程中，ALT和AST能够反映肝细胞的受损程度，本实验结果显示莪术经醋制后能够显著降低ALT和AST的表达水平，提示莪术经醋制后对肝细胞起保护作用。丙二醛能够反映体内脂质氧化水平，莪术经醋制后能够改善脂质过氧化，这可能与炮制辅料醋的抗氧化活性有关[14]，炮制辅料对于药物作用的影响值得进一步关注。

Friedman[15]提出肝纤维化的形成过程中HSC的活化起到关键作用。活化的HSC能够合成和分泌ECM，并表达α-平滑肌激动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。本实验选择的HSC-T6细胞系是活化的肝星状细胞，在体外培养自动活化，经生、醋莪术含药血清给药后，均能抑制其增殖，且不同程度的抑制α-SMA和Procollagen Ⅰ的表达，醋莪术含药血清组更显著。

综合体内外实验分析，莪术治疗肝纤维化可能与其抑制肝星状细胞的增殖、减少胶原的形成、提高抗氧化活性有关。HSC的活化与细胞因子网络密切相关，主要包括转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等。HSC不仅可以通过旁分泌机制对内环境中的刺激因子发生反应，而且可通过自分泌形式作用于本身，通过细胞因子的级联反应而活化[16]。课题组在后期实验中将重点研究HSC中一系列细胞因子，以期阐释莪术醋制增强抗肝纤维化机制，为临床合理用药提供参考。

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[责任编辑 张宁宁]