原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的构建

杜 芳,刘 伟,刘 敏,刘 芳,王晓红

·论 著·

原代乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的构建

杜 芳1,刘 伟1,刘 敏1,刘 芳1,王晓红2

目的 构建体外培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型。方法 原代乳鼠心肌细胞培养至第5天进行干预，缺氧过程(H)将细胞置入1% O2、5% CO2、37 ℃三气培养箱内无糖无血清依次培养1、2、3、4 h，再复氧过程(R)更换含10%胎牛血清低糖DMEM正常培养6 h。将细胞共分5组：正常对照组，H1R6组，H2R6组，H3R6组，H4R6组。观察C组和各H/R组再复氧6 h时心肌细胞一般形态和超微结构，用CCK-8法检测细胞增殖情况，乳酸-丙酮酸法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。结果 与C组比较，各H/R组心肌细胞一般形态及超微结构损伤明显,随缺氧缺糖时间延长，其损伤逐渐加重；与C组比较，各H/R组细胞增殖减少，培养液LDH活性升高(P<0.05),随缺氧时间延长，细胞增殖逐渐减少(P<0.05)，培养液LDH活性逐渐升高(P<0.05)；与C组比较，各H/R组细胞早期凋亡率明显增加(P<0.05)，且随缺氧时间延长，凋亡率逐渐升高(P<0.05)。结论 成功建立乳鼠心肌细胞H/R损伤模型，该模型可靠稳定，重复性好，且缺氧时间以3 h为宜。

心肌细胞；缺氧；复氧；无糖；缺血-再灌注；损伤

近年来心血管疾病发病率逐渐升高，随着冠脉搭桥术、血管成形术、体外循环术、心脏移植术等的推广应用，心肌缺血-再灌注损伤现象越来越受到临床关注。因此，建立心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型对于在离体水平下研究心肌缺血-再灌注发生的机制具有重要意义[1]。目前已知的细胞缺氧方法很多，单纯性物理法和化学法制造的缺氧环境不稳定，O2浓度和缺氧时间不易控制，无法建立稳定可靠的H/R模型[2-3]，实验重复性较差，研究结果不具说服力[3-4]。本研究拟体外原代培养乳鼠心肌细胞，采用物理性缺氧(1% O2)，同时更换无糖DMEM培养基培养的方法，模拟缺血过程，恢复糖氧供给模拟再灌注过程，通过观察细胞一般形态和超微结构、细胞损伤酶活性以及细胞凋亡率，以期建立一种稳定可靠的体外心肌细胞缺血-再灌注损伤(MIRI)模型。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器:胎牛血清、低糖DMEM培养基、无糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶和L-谷氨酰胺均购自Gibco公司(美国)；Ⅱ型胶原酶、5 溴-2，5 溴脱氧核苷尿嘧啶(Brdu)、台盼蓝购自Sigma公司(美国 )；D-Hank’s 液、青链霉素混合液等其他试剂购自北京索莱宝科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)活性测定试剂盒(江苏南京建成生物工程研究所)；CCK-8细胞活力检测试剂盒(日本同仁公司)；Annexin V-FITC-PI 双染试剂盒(江苏南京贝博公司)。

1.2 原代乳鼠心肌细胞分离培养:以文献[5]介绍的方法分离培养乳鼠心肌细胞并加以改良，取6～8只3日龄内的SD大鼠[由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(宁)2015-0001]，以75%酒精全身擦洗3遍，无菌条件下取出心脏，用D-Hank’s 液清洗3次，取心尖处心肌组织，剪成1 mm3组织块。首次用0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶等量混合液共10 mL(酶量根据鼠心脏大小、数目调整),在37 ℃水浴下置于磁力搅拌器上消化15 min；弃去首次上清液，之后逐渐缩短每次消化时间、减少酶量，并收集细胞悬液。吸出上清液，加入培养液(10%胎牛血清，低糖DMEM培养基)终止消化，轻轻吹打均匀后4 ℃保存。最后一次消化结束，经200目筛网过滤，再以800 r/min离心5 min后弃去上清液，重悬于含1%青链霉素和10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中，吹打均匀后接种于直径为100 mm培养皿中，差速贴壁60～90 min。取上清液计数细胞(台盼蓝拒染法)，调整密度，以(3～4)×105个/mL的密度接种于6孔板或直径为60 mm培养皿内(预先用L-谷氨酰胺包被)，加入0.1 mmol/L Brdu (抑制成纤维细胞生长)，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，每隔24 h换液，培养至第5天进行干预。

1.3 心肌细胞H/R损伤模型的构建:心肌细胞培养至第5天进行干预。正常对照组细胞在5% CO2、37 ℃培养箱内培养。缺氧组缺氧时间依次为1、2、3、4 h，再复氧时间均为6 h，故共分4组：H1R6组，H2R6组，H3R6组，H4R6组。调整Thermo三气培养箱(Thermo公司,美国)参数：1% O2、5% CO2、37 ℃稳定1 h，同时将无糖DMEM培养基预先置入培养箱中预温、饱和。心肌细胞弃去原含血清的低糖DMEM培养基，PBS洗2遍，换不含血清的无糖DMEM培养基(6孔板，每孔1.5 mL)。将缺氧组细胞置入缺氧培养箱内(待培养箱预设条件达标后开始计时)，细胞接受缺氧、无糖、无血清分别培养1、2、3、4 h。复氧过程为弃去无糖DMEM培养基，换用含10%胎牛血清低糖DMEM培养基，5% CO2、37 ℃继续培养6 h。

1.4 观察指标

1.4.1 心肌细胞形态和结构观察:复氧6 h后，C组和各H/R组随机取3 皿，在倒置相差显微镜(Olympus 公司，CKX31，日本)下(×400)观察细胞形态和结构变化。

1.4.2 心肌细胞超微结构观察:取C组和各H/R组细胞，每组6皿，0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，1 000 r/min离心5 min，PBS漂洗，离心收集细胞，2%戊二醛固定15 min，离心收集细胞，再次固定1 h后离心弃上清液。1%锇酸4 ℃固定60 min，PBS漂洗，离心弃上清液，梯度酒精脱水、离心，环氧丙烷浸透包埋，60 ℃烤箱烘烤过夜，使之固化成硬块。修块切片后制成70 nm的切片，用枸醋酸铀、枸椽酸铅双重染色。

1.4.3 CCK-8检测细胞增殖情况：细胞接种于96孔板中(细胞数约5 000个/孔)，培养至第5天，C组及各H/R组(每组4孔)复氧6 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培养箱内孵育1 h，酶标仪测定450 nm处吸光度。实验重复3次。

1.4.4 细胞培养液LDH活性测定:取C组及各H/R组(细胞接种于6孔板，每组4孔)细胞上清液标本500 μl，-20 ℃保存，乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒同批检测，严格按照说明书进行操作，实验重复3次。

1.4.5 流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率：原代心肌细胞接种于6孔板(每组3复孔)，C组及各H/R组复氧6 h后，用胰酶消化心肌细胞，将预冷的PBS洗2次，1 000 r/min 离心5 min，收集细胞，用流式细胞仪(BD公司 Accuri C6，美国)检测细胞早期凋亡率。

2 结果

2.1 心肌细胞形态和结构观察(图1-图4，目录后)：C组细胞生长良好，大部分细胞贴壁逐渐扩展，呈梭形或不规则的星形，伸出伪足，交织成网，呈放射状排列；H1R6组细胞结构完整，表面颗粒增多；H2R6组细胞皱缩，表面颗粒明显增多；H3R6组细胞明显皱缩，伪足缩短或减少，间隙增宽；H4R6组细胞结构破坏，部分脱落悬浮。

2.2 心肌细胞超微结构观察(图5-图8，目录后)：C组细胞线粒体结构完整，体积大小不一，嵴较多、排列整齐；H1R6组细胞线粒体轻度肿胀，嵴仍清晰；H2R6组细胞线粒体肿胀明显，极少数嵴断裂；H3R6组细胞线粒体高度肿胀，部分线粒体膜破裂，嵴稀疏，可见透光区；H4R6组细胞线粒体结构几乎全破坏，嵴稀疏，可见多个空泡。

2.3 CCK-8法检测细胞增殖及细胞培养液 LDH活性测定结果比较：与C组比较，各H/R组细胞增殖减小，培养液LDH活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)；随缺氧时间延长，细胞培养逐渐减少(P<0.05)，培养液LDH活性逐渐升高(P<0.05)，见表1。

表1 正常对照组和各H/R组细胞培养及细胞培养液LDH活性的比较

2.4 流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率情况：细胞早期凋亡率H1R6组(8.37±0.78)%、H2R6组(12.80±2.86)%、H3R6组(20.37±1.33)%、H4R6组(31.93±1.65)%，与C组(3.27±0.15)%比较，各H/R组细胞早期凋亡率明显增加(P<0.05)，且随缺氧时间延长，逐渐升高(P<0.05)。

3 讨论

缺血-再灌注损伤是临床常见的病理生理过程，建立体外心肌细胞H/R损伤模型对探索心肌缺血-再灌注损伤机制、寻找有效干预药物具有重要意义。目前对于成功建立心肌细胞H/R损伤模型没有统一标准，多数研究者通过检测细胞活力和细胞凋亡率等指标，以确定造成稳定的细胞损伤[6]，为后续研究奠定基础。

本实验采用稳定的可监测O2浓度的三气培养箱(1% O2、5% CO2、37 ℃)制造缺氧环境，同时为更好模拟体内缺血过程，在缺氧时更换无糖、无血清DMEM培养基培养，建立乳鼠心肌细胞H/R模型，使实验条件稳定、标准化、可重复。通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞早期凋亡率(Annexin V-FITC-PI染色)，心肌细胞损伤酶学指标改变定量评估细胞损伤，同时结合细胞一般形态和超微结构改变，确定合适的缺氧时间。

本研究发现，随着缺糖缺氧时间延长(由1～4 h)，光镜下观察到细胞表面颗粒增多，细胞皱缩，伪足减少，缺氧4 h心肌细胞结构破坏，脱离贴壁生长。电镜下见心肌细胞线粒体明显肿胀，嵴断裂、稀疏，缺氧4 h时线粒体结构几乎全破坏，可见多个空泡，细胞损伤过重。LDH是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，心肌细胞LDH活性远高于血清数百倍。任何原因引起的细胞损伤均可使LDH逸出[7-9]。细胞线粒体中的脱氢酶可将CCK-8还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，该产物数量与活细胞的数量呈正比。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量[10]。本研究证实，与正常对照组相比，各H/R组细胞培养液LDH活性升高，细胞增殖减少，且随缺氧时间延长，LDH活性逐渐升高，细胞增殖逐渐减少，以缺氧4 h最明显。细胞凋亡是心肌缺血-再灌注损伤细胞死亡的重要机制，与正常对照组相比，各H/R组细胞早期凋亡率均增加，且随缺氧时间延长，凋亡程度逐渐加重，缺氧4 h细胞凋亡率已超过30%。

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Construction of hypoxia/reoxygenation injury model in primary neonatal rat myocytes

DU Fang1, LIU Wei1, LIU Min1, LIU Fang1, WANG Xiaohong2.

1.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Department of Intensive Care Unit,General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,China

WANG Xiaohong,Email：wxhhelen2005@sina.com

Objective To establish a model of hypoxia / reoxygenation (H/R) injury in the cultured neonatal rat myocytes in vitro.Methods Cardiomyocytes isolated from neonatal rat hearts were cultured for 5 days. Cardiomyocytes being subjected to hypoxia (H) were placed in glucose-free and serum-free DMEM and submitted to hypoxic conditions in tri-gasincubator (1%O2,5% CO2,37 ℃) for a periods. Cardiomyocytes were exposed to hypoxia for 1hr, 2hrs,3hrs and 4hrs respectively. Then followed by reoxygenation, the myocytes recieving reoxygenation (R) were incubated in low glucose DMEM medium containing 10% fetal bovine serum for a further 6hrs. Thus, the cells were divided into five groups: control group (group C), group H1R6, group H2R6, group H3R6 and group H4R6. After 6hr of reoxygenation, morphological features and ultrastructure changes in cardiomyocytes were observed, cell viability was measured by CCK-8 assay, the activity of lactate dehydrogenase (LDH) was determined by lactic acid-pyruvate method and the early cell apoptotic rate was detected by flow cytometry.Results Compared with group C, the morphology and the ultrastructure of cardiomyocytes were obviously damaged in H/R groups, with increasing time of oxygen-glucose deprivation, the damage of cardiomyocytes gradually aggravated; Compared with group C, the cell viability decreased and the LDH activity in the culture media increased in H/R groups (allP<0.05), with the increase of hypoxia time, the cell viability decreased gradually (allP<0.05) and the LDH activity in the culture media increased gradually (allP<0.05); Compared with group C, the early apoptotic rate of H/R groups were significantly increased (all P<0.05), and with the increase of hypoxia time, the early apoptotic rate were increased gradually (allP<0.05). Conclusion The model of hypoxia / reoxygenation (H/R) injury in the cultured neonatal rat myocytes is established successful. This model is reliable, stable and can be repeated well, the oxygen-glucose deprivation time for 3hrs is more appropriate.

Cardiomyocytes;Hypoxia;Reoxygenation;Glucose-free;Ischemia-reperfusion;Injury

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0577

国家自然科学基金资助项目(81460288);宁夏自然科学基金资助项目(NZ1242)

1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004 2.宁夏医科大学总医院ICU，宁夏 银川 750004

杜芳(1991-)，女，在读硕士研究生，从事重症医学研究方向。

王晓红，Email：wxhhelen2005@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0844.002.html

R332

A

2017-02-14 [责任编辑]王凯荣