褪黑素对急性百草枯中毒大鼠肾损伤保护作用的研究

宫 玉，陈 慧，孟兆华，吕宝谱，姚冬奇，田英平

(河北医科大学第二医院急诊科，河北 石家庄 050000)

·论 著·

褪黑素对急性百草枯中毒大鼠肾损伤保护作用的研究

宫 玉，陈 慧，孟兆华，吕宝谱，姚冬奇，田英平*

(河北医科大学第二医院急诊科，河北 石家庄 050000)

目的观察百草枯中毒大鼠血浆尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)含量的变化，肾组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达及褪黑素对其的影响，探讨百草枯中毒所致肾损伤的机制及褪黑素对百草枯中毒大鼠肾损伤的保护作用。方法将健康成年SD大鼠90只随机分对照组、染毒组及褪黑素组，每组30只。染毒组和褪黑素组一次性给予50 mg/kg百草枯灌胃染毒后，褪黑素组立即给予褪黑素10 mg/kg腹腔注射、1次/d，染毒组每日给予等量生理盐水腹腔注射，分别于染毒后第1、3、5、7、14天各取6只大鼠, 心脏取血，观察比较血浆BUN、Cr含量的变化，取肾组织标本行免疫组织化学法检测大鼠肾组织TGF-β1的表达。结果染毒组大鼠BUN在各时点均明显高于对照组,褪黑素组BUN在各时点均较染毒组降低，但仍高于对照组(P<0.05);染毒组和褪黑素组BUN第1～5天持续升高，第7天开始逐渐下降，差异均有统计学意义(P<0.05); 染毒组Cr在各时点均高于对照组，褪黑素组除第1天外，第3～14天均低于染毒组，但仍高于对照组(P<0.05),对照组各时点之间差异无统计学意义(P>0.05),染毒组和褪黑素组在第1～5天Cr持续升高，到第7天开始逐渐降低，差异均有统计学意义(P<0.05);染毒组TGF-β1水平在各时点均高于对照组，褪黑素组除了第3天外，TGF-β1均低于染毒组，但仍高于对照组(P<0.05)。结论TGF-β1参与了百草枯中毒肾损伤的发病过程；褪黑素对百草枯中毒肾损伤有保护作用，其可能是通过抑制TGF-β1起作用。

百草枯；中毒；褪黑素

百草枯是目前全球使用最广的除草剂之一[1]，百草枯除草效果好， 喷洒后能很快发挥作用，接触土壤后迅速失活，一般在土壤中无残留，但它对人畜具有很强毒性，每年因自服或误服引起的急性中毒时有发生。急性百草枯中毒病情凶险，临床上尚无特效解毒药，病死率高，成为当今中毒治疗学的研究热点[2]。百草枯中毒后导致急性肺损伤继发多脏器功能障碍和肺间质纤维化是主要的死亡原因，病死率高达50%～90%[3]。肾脏是百草枯中毒的主要排泄器官和靶器官，肾功能受损程度是决定患者预后的关键[4]。早期保护肾功能，对降低百草枯中毒病死率具有积极意义。褪黑素是目前已知的抗氧化作用最强的内源性自由基清除剂，推测褪黑素能减轻百草枯中毒所致组织过氧化损伤。本研究通过观察百草枯中毒后肾功能改变及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在百草枯中毒肾脏中的表达及褪黑素对上述指标的影响，探讨百草枯中毒所致肾损伤的机制及褪黑素对百草枯中毒大鼠肾损伤的保护作用。报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立 选择健康成年SD大鼠90只,雌雄各半，体质量220～250 g(河北省实验动物中心提供，合格证：612110)。将健康成年SD大鼠90只随机分为3组各30只。对照组：1 mL生理盐水一次性灌胃。染毒组：百草枯按50 mg/kg用生理盐水稀释到1 mL一次性灌胃染毒，然后给予生理盐水腹腔注射，每日1次。褪黑素组：百草枯按50 mg/kg用生理盐水稀释到1 mL 一次性灌胃染毒，然后立即给予褪黑素10 mg/kg腹腔注射，每日1次。

1.2 材料及试剂 质量分数为20%百草枯溶液(英国先正达有限公司)，褪黑素(美国Sigma公司)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，链霉亲和素-生物素标记(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫组织化学染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。日本7060C全自动生化分析仪。-85 ℃超低温冰箱、电热恒温水箱、离心机等均由河北医科大学第二医院提供。

1.3 方法 3组大鼠分别于不同处理后第1、3、5、7、14天各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后，开胸，先心脏取血，采集非抗凝血3 mL，低温下3 000 r/min离心15 min，取上清液，分别装于干燥的EP管中，存放于-85 ℃低温冰箱冷冻，应用全自动生化分析仪观察血浆中尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine,Cr)含量的变化。肾组织去掉包膜浸泡于盛有10%中性甲醛溶液的小瓶中固定，以备HE染色观察肾组织病理学变化及免疫组织化学观察。

采用SABC法进行染色，具体步骤如下：取出大鼠肾组织，常规中性甲醛固定，石蜡切片脱蜡至水，3%双氧水溶液室温孵育30 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，微波抗原修复， 10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭游离的结合位点，以减少非特异性染色，倾去血清，滴加稀释的一抗(PBS稀释，阴性对照以PBS代替一抗)，4 ℃过夜，滴加生物素标记二抗工作液及过氧化物酶标记链霉卵白素工作液， DAB显色剂显色。光镜下阳性反应部位为棕黄色，细胞核呈淡蓝色。光镜下低倍视野(×100)观察反应情况，分别随机选取5个高倍视野(×400)，运用免疫组织化学分析软件(由北京航天航空大学医学图像分析系统监测处理)对所选视野内阳性信号进行图像分析。分别计算每个视野的阳性染色的平均光密度(mean optical density,MOD)值，取其平均值进行统计学处理。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠中毒表现 染毒组大鼠在染毒后30 min～2 h即出现倦怠、嗜睡、烦躁，进食水明显减少，呼吸急促、张口呼吸、口周发绀，血尿、少尿。褪黑素组经治疗后症状体征较染毒组减轻，尤其是呼吸困难和血尿明显改善。

2.2 各组大鼠血浆BUN、Cr和TGF-β1水平比较 组间比较：染毒组大鼠BUN在第1、3、5、7、14天各时点均明显高于对照组，褪黑素组BUN在各时点均较染毒组降低，但仍高于对照组(P<0.05)；同组不同时点间比较：对照组BUN在第5天开始升高，第7天开始下降，第14天又升高，染毒组和褪黑素组第1、3、7天持续升高，第7天开始逐渐下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较：染毒组Cr在第1、3、5、7、14天各时点均高于对照组(P<0.05)，褪黑素组除第1天外，第3、5、7、14天均低于染毒组，但仍高于对照组(P<0.05)；同组不同时点间比较：对照组Cr在各时点之间差异无统计学意义(P>0.05),染毒组和褪黑素组在第1、3、5天Cr持续升高，到第7天开始逐渐降低(P<0.05)。对照组肾小管偶见TGF-β1表达，而肾小球、肾小管周围毛细血管和大血管内皮细胞均未见明显TGF-β1表达；染毒组TGF-β1主要表达在肾小管上皮细胞的胞质中。组间比较：染毒组TGF-β1水平在各时点均高于对照组，褪黑素组除第3天外，TGF-β1均低于染毒组，但仍高于对照组(P<0.05)；同组不同时点间比较：褪黑素组TGF-β1在第1、3天缓慢下降，第5天有升高，第7、14天又缓慢下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血浆BUN、Cr和TGF-β1水平比较Table 1 Comparison of changes of plasma BUN and Cr Levels and the expressions of TGF-β1 in rats

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05 与染毒组比较 aP<0.05 与第1天比较 bP<0.05与第3天比较 cP<0.05 与第5天比较 dP<0.05与第7天比较(SNK-q检验)

3 讨 论

百草枯是1,1′-二甲基-4,4′-联吡啶二氯化物，由于它对周围环境无害，而且除草效果好，因此在全世界范围内广泛应用[5]。但如果使用不当、误服、自杀性服用都可导致中毒，一旦中毒，病程进展快且尚无特效解毒药物，临床上病死率很高。百草枯可损害多个脏器，肾脏是主要受累器官之一。急性肺损伤继发多脏器功能障碍和肺间质纤维化是主要的死亡原因。胡蜂等[6]回顾性分析得出百草枯中毒急性肾损伤是判断病情严重程度的指标，BUN和Cr是反映肾脏功能的重要指标。本研究结果显示，染毒组血浆BUN和Cr第1天即就明显升高，第5天达到高峰，维持较高水平至第14天，较对照组明显升高，肾功能损伤明显，应用褪黑素处理后各时间点血浆BUN和Cr水平下降，肾功能损伤减轻。表明褪黑素对百草枯中毒引起的肾损伤有保护作用。有研究表明减轻百草枯中毒肾损伤对改善预后、提高生存率有重要意义[7]。

百草枯中毒肾损伤的机制可能与氧自由基损伤、氧化/抗氧化失衡、炎性因子及细胞因子的网络激活、肾脏血流动力学改变及毒物本身影响等有关[8]。百草枯引起肾损伤时其吡啶阳离子还原和再氧化过程中生成大量氧自由基[9-10]。百草枯引起的大量氧自由基，可直接刺激多种炎性细胞因子的表达，如TNF-α、TGF-β、IL-10等，并由此引发一连串的链式反应，构成一个复杂的细胞因子网络，使中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞聚集、活化，进而释放更多的炎症介质、氧自由基和蛋白水解酶等，造成组织细胞损伤[11]。本研究结果显示，染毒组肾组织TGF-β1集中表达于肾小管上皮细胞，染毒第1天时明显表达，第5天达高峰，直至第14天时仍有表达，且明显高于对照组。表明百草枯引起的大量氧自由基可通过刺激TGF-β1过度表达，造成严重肾损伤。TGF-β主要存在于哺乳动物中[12], TGF-β1 具有多重生物效应，包括参与细胞增殖与分化、免疫功能抑制及细胞外基质形成、分泌，特别是在诱导上皮间质转化中起关键作用[13]。在百草枯中毒肾损伤早期可能与ICAM-1等多种细胞因子共同促进单核-巨噬细胞和多形核中性粒细胞在损伤部位的聚集，即在损伤早期作为炎症因子发挥其促炎作用,晚期作为纤维化的“总开关”，发挥其致纤维化的作用[14]。本研究TGF-β1在百草枯中毒后肾组织的持续高水平表达，可能对肺间质纤维化形成起了一定作用。国内学者已在百草枯中毒大鼠及百草枯中毒患者体内均发现血清TGF-β1浓度升高[15]。

氧自由基损伤是百草枯中毒肾损伤的主要发病机制之一，抗氧化剂对百草枯中毒的肾脏保护作用在动物实验研究中取得了一定的疗效[16]。褪黑素是松果体分泌的一种吲哚胺类激素，具有清除氧自由基的作用[17-18]，是迄今为止发现的最有效的自由基清除剂之一[19]。Kvtnoy[20]研究表明大鼠肾组织内存在褪黑素受体，褪黑素可以稳定细胞膜及各种细胞器生物膜，保护线粒体、微粒体免受氧自由基的破坏，减轻百草枯中毒肾损伤。本研究褪黑素组TGF-β1表达明显低于染毒组，可能与激活肾组织褪黑素受体、清除自由基、减轻肾损伤有关。肾脏作为百草枯中毒后排泄器官及靶器官，人们加强了对百草枯中毒肾脏损伤的研究。保护肾脏功能、促进毒物排泄能有效减轻毒物对其他各脏器的进一步损害。本研究应用褪黑素干预，抑制了TGF-β1表达，但其具体途径和机制以及褪黑素的临床应用价值尚需进一步探讨。

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(本文编辑：许卓文)

Protective effect of melatonin on renal injury induced by acute paraquat poisoning in rats

GONG Yu， CHEN Hui， MENG Zhao-hua， LYU Bao-pu， YAO Dong-qi， TIAN Ying-ping*
(DepartmentofEmergency，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Objective To observe the changes of serum urea nitrogen(BUN), creatinine(Cr) in paraquat poisoning rats， and to study the mechanism of paraquat-induced renal injury in rats， the expression changes of transforming growth factor-β1(TGF-β1) to assess the protective effect of melatonin in paraquat poisoning. Methods Ninety adult healthy Sprague-Dawley(SD) rats were divided into three groups randomly, 30 rats in each group. Control group and poisoned group were treated intragastrically with 1mL of paraquat(50 mg/kg) diluted with normal saline. Control group were treated with the same dose of normal saline as poisoned group and melatonin group. melatonin group were given 1 mL of melatonin at a dose of 10 mg/kg diluted with normal saline(once daily, intraperitoneally). Control and poisoned group were treated with the same dose of normal saline(once daily, intraperitoneally) as melatonin group. Six rats in each group were sacrificed on the 1st, 3rd, 5th, 7th and 14th day after exposure. Blood samples were taken from the heart to observe the changes of plasma BUN and Cr. The expression of TGF-β1 in rat renal tissue was detected by immunohistochemistry. Results The BUN of the rats in the poisoned group was significantly higher than that in the control group at each time point， melatonin group BUN at all time points were lower than the poisoned group，but still higher than the control group. BUN in the poisoned group and melatonin group continued to increase from day 1 to day 5, and gradually decreased on the 7th day, the difference was statistically significant(P<0.05). The Cr concentration in the poisoned group was higher than that in the control group at each time point. Except for the first, 3 days to 14 days in days group were lower than that in poisoned group(P<0.05), but still higher than that in control group, and there was no significant difference between control group at each time point(P>0.05). The Cr in the poisoned group and the melatonin group continued to increase from day 1 to day 5, and gradually decreased on the 7th day, the difference was statistically significant(P<0.05). The levels of TGF-β1 in the poisoned group were higher than those in the control group at each time point，melatonin group was lower than that of the control group except the 3rd day, but still higher than the control group, the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion TGF-β1 is involved in the pathogenesis of paraquat poisoning kidney injury. melatonin has protective effect on paraquat poisoning kidney tissue, which might be mediated by TGF-β1 in the paraquat induced renal injury，but its regulation path still need a further exploration．

paraquat; poisoning; melatonin

2017-04-07；

2017-05-09

河北省医学科学研究重点课题(20150219)

宫玉(1981-)，女，满族，河北丰宁人，河北医科大学第二医院主治医师，医学硕士，从事急诊医学研究。

*通讯作者。E-mail1：sy8013460@sina.com

R916.4

A

1007-3205(2017)06-0633-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.06.004