超声波提取毛酸浆总黄酮研究

牛春艳，王海

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林132101）

超声波提取毛酸浆总黄酮研究

牛春艳，王海

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林132101）

以毛酸浆果实为原料，超声提取其中的总黄酮。经过单因素试验和正交试验设计、分析，研究乙醇浓度、超声时间、固液比、超声温度对毛酸浆总黄酮提取率的影响，从而得到最佳提取条件：乙醇浓度60%、超声时间30min、固液比1：30、超声温度40℃，此时总黄酮提取率最高，为5.77%。

超声波；毛酸浆；总黄酮

毛酸浆（Physalispubescens L.）也被称为洋菇娘、黄菇娘，在我国，毛酸浆主要分布于我国东北地区，吉林省与黑龙江省产量居多。毛酸浆浆果柔嫩多汁，具有清香可口气味和酸甜淡雅的口感。毛酸浆浆果具有一定的药用价值，有降低血压、解除肌肉疼痛与疲惫、对动脉硬化和心血管疾病具有预防与保护等功效[1]。毛酸浆中含有黄酮类与生物碱[2]，此外还有多种脂溶性油状成分，如醛类、酯类、有机酸等，其果实中还含有丰富的维生素C、柠檬酸、类胡萝卜素与多种矿物质和人体需要的氨基酸[3-4]。黄酮（flavone）为黄酮类化合物的总称，拥有多种生物活性，大多黄酮类化合物都有较强的抗氧化自由基活性，它能够有效清除体内的自由基[5-6]。本试验以毛酸浆果实为原料，以乙醇作为提取溶液，超声提取黄酮。通过一系列试验，确定最佳工艺，提取毛酸浆总黄酮，为毛酸浆的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

毛酸浆鲜果（市售）、芦丁、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、维生素C等试剂均为分析纯试剂（吉林农业科技学院食品营养分析实验室提供）。

1.2 试验仪器与设备

UV-721可见分光光度计（上海欣茂科技仪器有限公司）；FA2103型电子分析天平（北京赛多利斯系统有限公司）；KQ-100DE型高频超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；800B型台式离心机（上海市安亭科学仪器厂）；FLB-200A型万能高速粉碎机（上海市菲力博食品机械公司）；DHG-9420B型恒温鼓风干燥箱（深圳爱特尔电子科技有限公司）。

1.3 毛酸浆中总黄酮的提取

1.3.1 工艺流程

1.3.2 毛酸浆总黄酮提取率

（1）芦丁标准曲线的制作

芦丁标准液的制备：准确称取0.1250g芦丁标品，溶解在60%的乙醇，如溶解不充分，可适当水浴促使其加速溶解，溶解后全部转移至250mL的容量瓶中，加入60%乙醇定容到刻度，摇匀，得到的标准芦丁溶液（其浓度为0.5mg/mL），储存、备用。

芦丁标准曲线的制作：分别准确移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL芦丁标准液置于25mL容量瓶中，添加0.7mL 5%的NaNO2溶液，充分摇晃，静置5min，添加0.7mL 10%的Al（NO3）3溶液，充分摇晃，静置5min，再添加5mL 1mol/L的NaOH溶液，用60%乙醇定容到刻度线，充分摇晃，静置15min（制得浓度为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ mL芦丁溶液），用紫外分光光度计在最大吸收波长（λmax=510nm）处测定吸光度值。用60%乙醇作参比溶液，吸光值—纵坐标，芦丁—横坐标，制作芦丁标准曲线，得线性回归方程以及相关系数R2。

（2）总黄酮提取率的计算

采取硝酸铝—亚硝酸钠比色法，取毛酸浆总黄酮提取液1mL置于100mL的容量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度。在相同条件下于λmax= 510nm处测定其吸光值，代入芦丁标准曲线的线性回归方程，由此计算毛酸浆总黄酮提取液的质量浓度，经换算后得毛酸浆总黄酮提取率σ，其计算公式为：

式中：α—毛酸浆总黄酮提取液稀释倍数；

V—毛酸浆总黄酮提取液原有体积，mL；

C—毛酸浆总黄酮的质量浓度，mg/mL；

M—所用毛酸浆的质量，mg。

1.4 单因素试验

经过查阅有关文献与预实验，影响提取率的因素主要是：乙醇浓度，超声时间，固液比和超声温度，为确定毛酸浆总黄酮的最佳提取工艺条件，需先通过单因素试验及其散点折线图进行分析，后通过正交试验及其数据极差分析确定最佳提取工艺。

1.4.1 乙醇浓度对毛酸浆总黄酮提取率的影响精密称取毛酸浆粉末3.00g，共5份，在固液比1：20的条件下，分别加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，然后放在超声波清洗机中，控制超声辅助提取温度40℃，超声辅助提取30min。

1.4.2 超声时间对毛酸浆总黄酮提取率的影响精密称取毛酸浆粉末3.00g，共5份，在固液比1：20的条件下，加入60%的乙醇溶液，然后放在超声波清洗机中，控制超声辅助提取温度40℃，分别超声辅助提取10、20、30、40、50min。

1.4.3 固液比对毛酸浆总黄酮提取率的影响精密称取毛酸浆粉末3.00g，共5份，固液比分别在1：10、1：15、1：20、1：25、1：30的条件下加入60%乙醇溶液，然后放在超声波清洗机中，控制超声辅助提取温度40℃，超声辅助提取30min。

1.4.4 超声温度对毛酸浆总黄酮提取率的影响精密称取毛酸浆粉末3.00g，共5份，在固液比1：20的条件下，加入60%的乙醇溶液，然后放在超声波清洗机中，分别控制30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的超声辅助提取温度，超声辅助提取30min。

1.5 正交试验分析

在单因素试验基础上，利用正交试验设计及其数据分析原理，分别考察乙醇浓度、超声时间、固液比和超声温度4个因素（每组3个平行）对毛酸浆总黄酮提取率的影响。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的制定

采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法显色，于在λmax=510nm波长处用721紫外分光光度计测定吸光度值。以60%乙醇为参比溶液，横坐标为芦丁浓度，纵坐标为吸光度值，如图1。

图1 芦丁标准曲线

线性回归方程经过计算得：Y=11.53X-0.0075，R2=0.9995，λmax=510nm处测得芦丁吸光值，X—芦丁标液的浓度（mg/mL），结果显示线性关系呈现良好。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 乙醇浓度对毛酸浆总黄酮提取率的影响选定超声温度为40℃、固液比为1：20、提取时间为30min，以乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%5个水平）作为考察对象，考察乙醇浓度对提取率的影响（见图2）。

图2 乙醇浓度对毛酸浆总黄酮提取率的影响

图2显示，乙醇浓度在30%~60%的范围内，毛酸浆总黄酮提取率随浓度的加大而升高，乙醇浓度60%，毛酸浆总黄酮提取率最大值；当乙醇浓度再增大时，提取率却下降了。这可能是因为毛酸浆黄酮中存在酚羟基，酚羟基是活性基团，与水、乙醇形成氢键；而乙醇浓度亦不能太大，否则适得其反，会造成非目标提取成分的溶出，加大后期分离纯化的难度。所以，选定乙醇浓度为50%～70%。

2.2.2 超声时间对毛酸浆总黄酮提取率的影响选定超声温度为40℃、乙醇浓度为60%、固液比为1：20，以超声时间（10、20、30、40、50min 5个水平）作为考察对象，考察超声时间对提取率的影响（见图3）。

图3 超声时间对毛酸浆总黄酮提取率的影响

图3显示，超声作用时间越长毛酸浆总黄酮提取率先增加，然后随之而减少，当超声时间10～30min范围内，呈现上升的走势，超声时间30min后，其提取率最高，随后，毛酸浆总黄酮的提取率都出现下降。因为超声提取时间过长，黄酮分子和其他物质反应加强，使黄酮遭到破坏，也会使其暴露于空气之中时间过长，使之氧化加深，使得毛酸浆总黄酮含量降低。选定超声提取时间为20～40min。

2.2.3 固液比对毛酸浆总黄酮提取率的影响选定乙醇浓度为60%、超声温度为40℃、超声时间为30min，以固液比（l：10、l：15、l：20、1：25、l：30 5个水平）作为考察对象，考察固液比对提取率的影响（见图4）。

图4 固液比对毛酸浆总黄酮提取率的影响

图4显示，固液比1：10～1：25时，固液比增加，提取率加大，1：25后，提取率下降，分析原因，随着固液比中乙醇用量的增加，与毛酸浆粉末接触面的浓度差增大，毛酸浆总黄酮就容易渗透出来，从而加快了溶质的扩散速度，浸出速度也随之提高，从而使黄酮提取率也随之大幅度提高。乙醇用量继续加大，提取剂损耗加大，同时导致一些粘液类、树脂成分大量溶出，附着于毛酸浆粉末表面，减慢了黄酮类物质的浸出速度，同时加大了分离、纯化、浓缩的难度。从提取效果和节约溶剂用量等方面综合考虑，选定固液比考查范围为1：20～1：30（g/mL）。

2.2.4 超声温度对毛酸浆总黄酮提取率的影响选定乙醇浓度为60%、超声时间为30min、固液比为1：20，以超声温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃5个水平）作为考察对象，考察超声温度对提取率的影响（见图5）。

图5 超声温度对毛酸浆总黄酮提取率的影响

图5显示，在超声温度30～50℃，提取率呈现上升的走势，但是比较缓慢，温度达到50℃时，提取率趋于平缓或略有下降。其原因可能是超声温度升高，分子动能高，运动速度快，黄酮物质扩散、渗透、溶出速度加快，使其更容易从细胞中转移到提取剂中的缘故。结合节能经济等因素，考查范围定为40～60℃。

2.3 正交试验确定最佳工艺条件

2.3.1 正交试验因素与水平设计考察乙醇浓度、超声时间、固液比和超声温度（每组3个平行）对毛酸浆总黄酮提取率的综合影响。按L9（34）正交试验表严格控制试验条件，提取毛酸浆总黄酮，经分离、稀释后，测定最大吸收处的吸光度值，从而求得提取率。见表1。

表1 正交试验设计的各因素与水平

2.3.2 正交试验结果表见表2。

表2 L9（34）正交试验设计

根据表2正交试验及其数据误差分析可知，由极差R值可以得到各因素对毛酸浆总黄酮提取率的显著关系顺序：A＞C＞B＞D，即主要因素为乙醇浓度，其次要因素为固液比和超声时间，最后是超声温度。毛酸浆总黄酮的最佳提取的工艺参数为A2B2C3D2，但正交试验结果中不存在这个组合，必须通过验证试验，比较这两种组合，确定最佳条件。结果显示A2B2C3D2组合提取率与A2B2C3D1相差不大，根据操作方便，节约能源等既定条件，从而确定毛酸浆总黄酮最佳提取工艺条件为A2B2C3D1，乙醇浓度为60%，超声时间为30min，固液比为1：30，超声温度40℃，在此条件下毛酸浆总黄酮的提取率最高为5.77%。与此进行对比，单纯采用溶剂浸提法提取毛酸浆总黄酮，其最佳提取工艺条件乙醇浓度为70%，浸提时间为3h，固液比为1：40，浸提温度70℃，提取率最高为3.89%。在与传统的溶剂浸提法相比之中，超声波辅助提取法体现出耗能低、效率高、不破坏有效成分、杂质少、无需高温、安全性好、操作简便易行等优点。

3 结论

本试验在提取毛酸浆的总黄酮中，使用超声波，并且通过单因素试验，考察乙醇浓度，超声时间，固液比和超声温度，随后正交试验。结果显示：乙醇浓度对毛酸浆总黄酮提取率的影响是最大的，超声时间次之，随后是固液比和超声温度。由此得到最佳工艺条件：A2B2C3D1，即乙醇浓度60%、超声时间30min、固液比1：30、超声温度40℃，在此这种条件下毛酸浆总黄酮的提取率最高为5.77%。在食品等领域中毛酸浆总黄酮应用价值很高，是安全的抗氧化剂，并且能开发为功能性食品。

[1]丰利，高倩倩.酸浆和甜菇娘的营养成分分析[J].安徽农业科学，2012，40（33）：16113-16114.

[2]古勇，李安明.类黄酮生物活性的研究进展[J].应用与环境生物学报，2013，12（2）：283-286.

[3]韩公羽，沈企华，韩绍雯.植物药黄酮成分与生理生化活性[M].北京：中国书籍出版社，2010：1-3.

[4]熊双丽，李安林.夏枯草总黄酮提取分离与自由基清除活性研究[J].食品科学，2010，31（22）：102-104.

[5]郑义，邵颖，陈安徽，等.益智仁总黄酮超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性[J].食品科学，2014，35（6）：44-49.

[6]陈永刚，刘晓涵，林励.超声法提取化橘红中黄酮类物质工艺优选[J].中药材，2009，32（1）：138-142.

责任编辑：吴艳玲

Study on the Extraction of Total Flavonoids from Physalispubescens by UltrasonicW ave

NIU Chunyan,WANG Hai

（Jilin AgriculturalScience and Technology University,SchoolofFood Engineering,Jilin 132101）

In this paper,with the fruits of Physalispubescens as raw materials,itaims to use themethod of ultrasonic in the extraction of the Physalis pubescens of total flavonoids.Through single factor test and orthogonal test,the effects of ethanol concentration,ultrasonic temperature,solid-liquid and ratioultrasonic time,on the extraction rate of the Physalispubescens extractwere studied.The optimum technological condition is like this:60%of ethanol concentration,30 minutes ultrasonic time,1:30－solid-liquid ratio,40℃－ultrasonic temperature.Under this condition,theextraction rate of total flavonoidswas thehighest,at5.77%.

ultrasonic;Physalispubescens;total flavonoids

R 284.2

A

2016-08-20

牛春艳（1981-），女，吉林省乾安县人，讲师，从事活性成分制备与应用方面研究。