兔舍内气载革兰氏阴性菌群的检测

段会勇

（泰山职业技术学院生物技术工程系，山东 泰安 271000）

疾病防控

兔舍内气载革兰氏阴性菌群的检测

段会勇

（泰山职业技术学院生物技术工程系，山东 泰安 271000）

采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器，以5%公绵羊血琼脂和麦康凯3号培养基为采样介质，分别对3个不同兔场环境中气载需氧菌含量、气载革兰氏阴性菌含量与菌群组成进行了检测。结果表明：兔舍内气载需氧菌含量在0.78×103～20.10×103CFU/m3之间，气载需氧革兰氏阴性菌含量在0.39×102～10.30×102CFU/m3之间，占需氧菌总数的2.12%～10.20%；革兰氏阴性菌群包括肠杆菌、奈瑟氏菌、巴氏杆菌和假单胞菌，肠杆菌科细菌中大肠埃希氏菌占多数。在其中2个兔舍中还检测到可导致兔发生肺炎的肺炎克雷伯氏菌。

兔舍；气载革兰氏阴性菌；微生物气溶胶

随着集约化、规模化畜牧生产的发展和养殖经验的积累，人们已经越来越深入地认识到微生物气溶胶在流行病传播中所占的重要地位。畜禽主要烈性传染病大都通过气源性传播，给畜牧业造成极大的危害和损失。因此，全面了解畜禽舍内、外环境空气微生物菌群、含量、分布情况及特性，对于建立气源性传染的传播模型及流行病的预防和监控十分重要。

国外在畜禽舍环境与人类和动物的健康方面的众多研究表明，空气质量状况会影响人及动物健康，空气质量差会导致动物及人类一些疾病的发生，主要是呼吸道疾病、免疫下降等，特别是空气中的微生物及其代谢产物（内毒素、氨、硫化氢等），是影响动物健康的潜在因素［1］。

国内外对细菌气溶胶的研究报道中，革兰氏阴性菌仅占较小的比例，但其中包含了大量的致病菌和条件性致病菌，其浓度和组分对于动物舍内环境质量具有重要意义。许多科研工作者都对动物舍内环境中的革兰氏阴性菌浓度和组分进行了研究［2-4］。Zucker-BA等［5］对4个牛舍、1个猪舍和1个鸡舍中的气载革兰氏阴性菌的种类和含量进行过研究，发现畜舍内气载革兰氏阴性菌占气载需氧菌总数的0.02%～5.20%，未分离出厌氧革兰氏阴性菌；并指出革兰氏阴性菌中主要包括肠杆菌、假单胞菌及奈瑟氏菌，肠杆菌中以大肠杆菌和成团肠杆菌为主，空气湿度大的地方假单胞菌的含量也非常高。本研究对3个不同结构和饲养方式下的兔场兔舍中气载需氧、厌氧革兰氏阴性活菌的含量进行了测定，并对微生物气溶胶中革兰氏阴性菌菌群组成进行了检测，以期为相关疫病的预防和监控提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 兔舍情况

实验兔场有两个开放式兔舍（A、B）和一个封闭式兔舍（C）。开放式兔舍为双列3层式，兔舍长15m，宽4m，高3m；封闭式兔舍长6m，宽4m，高3m，采用空调控温。舍内外温湿度、风速在采样时同时进行检测，具体指标见表1。

表1 3个兔舍物理指标

1.2 方法

1.2.1 气载需氧菌和革兰氏阴性菌样本的采集 采用2台国际标准收集器ANDERSEN-6级撞击式空气微生物样品收集器［6］，采集时标准流量28.3 L/min，分别选用5%的公绵羊血琼脂和麦康凯3号培养基（Oxoid公司）为采样介质，收集器设置于兔舍中央，放置高度50～80 cm，驱动时间根据不同卫生条件掌握在1～5min，保证六节平皿上都能采到菌样，菌落数以20～250CFU为宜。1.2.2气载需氧菌浓度计算 采样后血琼脂平板置于恒温箱37℃需氧培养24 h后，计算各琼脂平板上的菌落数，经ANDERSEN校正表校正后，根据通气量得到每立方米空气中的气载需氧活菌含量。按公式①计算：

其中，Q1为六节平皿上菌落数量矫正后的总和；t为采样时间（min）。

1.2.3 革兰氏阴性菌浓度计算 用麦康凯3号培养基采集的样本一部分在37℃条件下培养24 h，另一部分放入YQX型厌氧培养箱中，40℃厌氧培养24 h，其厌氧环境为N288%、H27%、CO25%。所有的红色菌落经过革兰氏染色和“KOH反应”试验鉴定。计算各平板上的革兰氏阴性菌菌落数，ANDERSEN采集的样本经ANDERSEN校正表校正后，根据通气量得到每平方米空气中的气载革兰氏阴性活菌。按公式①计算。

1.2.4 革兰氏阴性菌菌群的鉴定方法

1.2.4.1 需氧和兼性厌氧革兰氏阴性菌的鉴定 将分离得到的纯菌种分别接种O-F生化管和氧化酶试纸，按照标准操作方法进行，再根据结果进行初步分离。O-F试验氧化（F）且氧化酶阳性（+）的菌株采用API-20E（Bio Merieux，Marcy-I’Etoile，France）实验进行鉴定，其他菌株采用API-20NE实验进行鉴定。操作及结果判读按试剂盒说明完成。

1.2.4.2 专性厌氧革兰氏阴性菌的鉴定 由于本次实验分离到的菌株大多数为兼性厌氧革兰氏阴性菌，未分离到专性厌氧革兰氏阴性菌，故未进行本实验。

2 结果

2.1 气载需氧菌和气载革兰氏阴性菌含量

经过检测，3个兔舍内气载需氧菌含量在0.78×103～20.1×103CFU/m3之间，总气载革兰氏阴性菌含量在29～58CFU/m3之间，占需氧菌总数的2.12%～10.20%。兔舍C内气载革兰氏阴性菌含量最高，兔舍B内含量最低（见表2）。可吸入的气载革兰氏阴性菌含量在19～35CFU/m3之间，兔舍C内含量最高，兔舍B内含量最低（见表2）。而且，每一个兔舍内气载需氧菌和革兰氏阴性菌含量差异均不显著（P＞0.05）。可吸入的气载革兰氏阴性菌含量占总气载革兰氏阴性菌含量的比例在62.7%～65.1%之间，而且3个兔舍之间无显著性差异（P＞0.05）。

表2 3个兔舍内气载革兰氏阴性菌含量

2.2 气载革兰氏阴性菌菌群组成

经过对3个兔舍环境中气载革兰氏阴性菌成分分析，结果表明，兔舍环境中肠杆菌科细菌是革兰氏阴性菌的主要组分（表3），分别占革兰氏阴性菌含量的64.3%（兔舍A）、84.2%（兔舍B）和72.3%（兔舍C）；其次是假单胞菌、奈瑟氏菌和巴氏杆菌。而在肠杆菌科中大肠杆菌是主要菌群（表4），分别占肠杆菌科细菌含量的90.5%（兔舍A）、92.5%（兔舍B）和87.6%（兔舍C）。

表3 3个兔舍舍内气载革兰氏阴性菌菌群分析%

表4 3个兔舍舍内气载肠杆菌科中各成分分析%

3 讨论

3.1 兔舍内气载革兰氏阴性菌的空气动力学分析

细菌在ANDERSEN-6空气微生物采样器1～6层级上（总的）分布的统计采用平均值的统计方法。因为不同结构、不同饲养方式的兔舍细菌含量差异较大，采用平均数能较好地反映数值分布。经统计，可吸入的气载革兰氏阴性菌含量占总气载革兰氏阴性菌含量的比例在62.7%～65.1%之间，这些颗粒的空气动力学直径（Dae50）一般在5.4μm以下，能在空气中做BROWN运动，停留时间长，可进入人畜的气管、支气管、细支气管甚至肺泡，在环境条件或饲养因素改变和动物体抵抗力下降时，容易造成下呼吸道感染，对人及动物健康构成威胁。

3.2 兔舍气载革兰氏阴性菌和气载需氧菌浓度

本实验测得兔舍内气载需氧革兰氏阴性活菌含量介于0.39×102～10.30×102CFU/m3之间，未检测出厌氧革兰氏阴性菌，说明进入空气中厌氧革兰氏阴性菌均未能形成芽孢，很快死亡。气载需氧菌活菌含量介于0.78× 103～20.10×103CFU/m3之间。气载革兰氏阴性活菌占气载需氧菌活菌总数的2.12%～10.20%。WIEGAND-B等［7］测定肉鸡舍空气尘埃中的细菌总数为2.1×109CFU/g，相当于7.7×106CFU/m3空气；Dutkiewicz-J等［8］测定猪舍、牛舍、马舍中嗜温菌含量分别在568.7×103～1 408.7×103CFU/m3、43.9×103～280.5×103CFU/m3、26.2×103～150.1×103CFU/m3之间；Zucker-BA等［9］测定牛舍中的需氧细菌含量和需氧革兰氏阴性细菌含量分别为6.96×103～1.06×105CFU/m3和7.20×100～5.05×102CFU/m3空气。本次实验在兔舍中测得的细菌总数与其他动物舍比较相对较低，这可能与家兔本身的生活习性和饲养方式（开放式或半开放式、笼养、颗粒料等）有直接关系。

3.3 兔舍环境革兰氏阴性菌菌群分析

在所测量的3个兔舍环境中，革兰氏阴性菌中以肠杆菌科细菌为主，而且在肠杆菌中又以大肠杆菌占大多数（表4），类似的结果以往的研究者也在猪舍和禽舍环境中检测到［5］。在奈瑟氏菌科中以黏液奈瑟氏菌最为常见（在兔舍A中占80.0%，在兔舍B中占57.1%，在兔舍C中占55.6%）。奈瑟氏菌科中有多种奈瑟氏菌（如年液奈瑟氏菌）可以在温血动物和人的黏膜处共生，特别是在鼻咽部及其结合处［10-11］。在兔舍环境中检测到很多假单胞菌科细菌，其中包括常见的铜绿假单胞菌，在以往的研究中已经发现此菌是引起人及动物伤口感染的主要菌［12-13］。另外，在其中的两个兔舍环境中（兔舍A和C）还检测到巴氏杆菌（表3），并且以多杀巴斯德氏菌为主，兔舍A中76.5%为多杀巴斯德氏菌，兔舍C中多杀巴斯德氏菌占84.5%，这与Kawamoto等［14］在日本报道的结果基本一致。多杀巴斯德氏菌是常见的呼吸道致病菌，通常巴斯德氏菌病与兔的上呼吸道疾病（以鼻炎、脓性鼻液为主要症状）并发，有时还伴有结膜炎、肺炎、溃疡、生殖器感染及败血症等［15-16］。在调查过程中，发现兔舍A和C中有些兔有鼻炎症状，而在兔舍B内未发现，与检测结果相一致。

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Detection on Airborne Gram-negative Bacterial Flora in Rabbitries

Duan Huiyong
（DepartmentofBiotechnology Engineeringof Taishan Polytechnic，Tai’an 271000，Shandong,China）

The concentration ofairborne aerobic bacteria，airborneaerobic gram-negativebacteriaand the species composition of the airborne gram-negative bacterial flora in 3 rabbitriesweremeasured using 5%buck blood-blood agar and MacConkey agar No.3（Oxoid）with Andersen-6 sampler.The resultsshowed that thenumberof totalairborne aerobic bacteriawasbetween 780 to 20 100CFU/m3，the number ofairborne aerobic gram-negative bacteria between 39 to 1 030 CFU/m3，the species composition of the airborne gram-negative bacterial flora included Enterobacteriaceae，Neisseriaceae，Pasteurellaceae and Pseudomonadaceae. Most of gram-negative Enterobacteriaceae isolated was E.coli.Besides，in two rabbit houses，Pasteurella multocida，themost common respiratory pathogen of rabbits，was isolated.

rabbithouse；airbornegram-negativebacteria；bioaerosol

S852.61

A

2095-3887（2017）04-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.009

2017-04-12

段会勇（1975-），男，讲师，博士，主要从事畜禽环境病原微生物的研究。