基于微透析技术的花椒挥发油在体经皮促透作用研究

兰颐　杨琳　史大勇　王英新　吴学萍　谢璇　吴清

[摘要]該文拟采用经皮微透析技术测定花椒挥发油对不同脂溶性中药成分皮肤药动学行为的影响，评价其在体经皮促透特征。选择川芎嗪和葛根素作为亲脂性和亲水性模型药物，采用浓差法考察微透析探针体外回收率与传递率，采用反向渗析法测定药物探针在体回收率；以常用化学促透剂氮酮为阳性对照，测定不同浓度花椒挥发油对川芎嗪和葛根素的皮肤药动学行力影响。结果显示，2种模型药物探针回收率与传递率相等，药物在渗析膜间无相互作用，川芎嗪和葛根素的在体相对回收率分别为5917%，1985%。在体经皮试验表明花椒挥发油对川芎嗪具良好促透效果，且呈浓度依赖性关系，5%花椒挥发油的在体促透倍数（ER）为9864，比氮酮最佳浓度的促透效果更好（3%氮酮，ER=8911）；同时，花椒挥发油也可显著增加葛根素的在体经皮吸收，也表现出浓度依赖性关系。因此，该研究进一步证实花椒挥发油作为经皮促透剂的良好促透性能，为其在中药外用制剂中的应用提供了数据支持。

[关键词]花椒挥发油； 微透析； 促透剂； 在体经皮吸收； 反向渗析法

[Abstract]The aim of this paper is to investigate the topical pharmacodynamics behavior of different lipophilic model drugs after treatment with essential oil from Zanthoxyli Pericarpium by using the cutaneous microdialysis technique， and then evaluate its in vivo transdermal penetration enhancing properties Two traditional Chinese medicine active components， namely tetramethylpyrazine and puerarin， were chosen as lipophilic and hydrophilic model drugs， respectively Firstly， the concentration difference method was employed to measure the in vitro recovery rate and loss of the microdialysis probe， and the in vivo recoveries of two model drugs were determined by using the retrodialysis method Secondly， the skin pharmacodynamics behaviors of two model drugs were studied after treatment with different concentrations of the essential oil， and the wellestablished and standard penetration enhancer Azone was selected as a positive control It was found that the recovery of microdialysis probe was equal to its loss for two model drugs， with no interaction between drugs in dialysis membranes The retrodialysis studies revealed that the in vivo recovery of tetramethylpyrazine and puerarin were 5917%， 1985%， respectively The skin pharmacodynamics studies showed that the essential oil could facilitate the transdermal absorption of tetramethylpyrazine in a concentrationdependent manner， and the enhancement ratio （ER） for 5% essential oil was 9864， which was higher than that of the optimum concentration of Azone （3% Azone， ER=8911） Meanwhile， the Zanthoxyli Pericarpium could effectively promote the transdermal permeation of the puerarin in a concentrationdependent manner Hence， this study further confirmed that the Zanthoxyli Pericarpium had excellent penetrationenhancing activity as a natural transdermal penetration enhancer， providing data support for its application in traditional Chinese medicine external preparations

[Key words]essential oil from Zanthoxyli Pericarpium； microdialysis； penetration enhancer； in vivo transdermal absorption； retrodialysis method

花椒为芸香科植物花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim或青椒Z schiniflium Sieb et Zucc的干燥成熟果皮，性温味辛，在中药外治方中多作引使药，利用其“气味俱厚”之性而“率领群药，直达病所”[1]，类似现代经皮促透剂。课题组前期研究也显示[24]，花椒挥发油对不同极性中药成分具良好经皮促透效果，且皮肤刺激性小，具备开发成天然经皮促透剂的潜力。但是，目前对花椒挥发油经皮促透效果的评价主要采用离体动物皮肤进行研究，尚缺乏活体动物的在体研究，考虑到离体皮肤与活体皮肤间差异，如皮下血流微循环、酶等对药物经皮通透性的影响，单一的体外促透数据尚不能充分了解其经皮促透效果[2]。

本文拟在前期体外经皮促透研究基础上[45]，分别选择川芎嗪（油水分配系数，lgP=234）和葛根素（lgP=-035）作为亲脂性和亲水性模型药物，采用经皮微透析技术测定花椒挥发油对模型药物经皮药动学的影响，研究其在体经皮促透特征，进一步验证花椒挥发油作为经皮促透剂的促渗性能，为其在中药外用制剂中的合理应用和天然经皮促透剂开发提供研究依据和数据支持。

1材料

微透析系统，包括Pump 11 Elite 型微量注射泵（HARVARD APPARATUS），25 mL 玻璃注射器（Hamilton），CMA 30 线性微透析探针（CMA，半透膜长度为1cm，截留相对分子质量6 000）；岛津高效液相色谱系统，包括LC20 AT泵、SPD20A双波长紫外检测器和LC Solution色谱工作站；TK20B药物透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；CP7800型电动递毛器（科德士电器有限公司）。

花椒药材购于北京本草方源药业有限公司（批号20131007，产地辽宁），经北京中医药大学中药炮制系谭鹏副教授鉴定为芸香科植物花椒Z bungeanum的干燥成熟果皮，采用水蒸汽蒸馏法提取花椒挥发油（收率约为29%），主要成分为4萜烯醇（1842%）、桉树脑（1549%）、柠檬烯（747%）等[3]。川芎嗪（SigmaAldrich，批号14003DEV）；葛根素（NCE Biomedical，批号20131209，纯度>9800%）；氮酮（国药集团化学试剂有限公司，批号F20110831）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司，批号20140312）；乙腈（Fisher，色谱纯）；其余试剂均为分析纯。

雄性SD大鼠[5周龄，体质量（200±10）g]，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证号[SCXK（京）2011004]

2方法

21川芎嗪HPLC方法的建立

色谱条件：Merck Purospher STAR RP18e色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈水（40∶60），流速10 mL·min-1，检测波长282 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，川芎嗪的相对保留时间约为56 min，理论榙板数川芎嗪峰计算就不低于5 000。

分别取川芎嗪微透析试验灌注液（即PBS溶液，pH 72）、川芎嗪对照液和川芎嗪微透析试验渗析液，考察色谱条件测定方法的专属性，结果显示渗析液中其他成分对川芎嗪的测定无干扰；称取川芎嗪对照品适量，用微透析灌注液配制系列对照品溶液（01，1，5，10，20，50，100，200，400 mg·L-1）考察方法线性关系，川芎嗪在01～400 mg·L-1线性关系良好，回归方程为y=31 97029x+55 41201 （R2=0999 5）；高、中、低3个质量浓度（即200，20，1 mg·L-1）的日内精密度分别为020%，012%，035%，日间精密度分别为27%，25%，24%；线性范围内高、中、低3个质量浓度（即200，20，1 mg·L-1）的方法回收率分别为9761%，9580%，9559%，方法回收率良好。

22葛根素HPLC方法的建立

色谱条件：Grace Alltima HP C18 AQ色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈水（20∶80），流速10 mL·min-1，检测波长251 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，葛根素的相对保留时间约为53 min，理论榙板数葛根素峰计算就不低于5 000。

分别取葛根素微透析试验灌注液（即PBS溶液，pH 72）、葛根素对照液和葛根素微透析试验渗析液，考察色谱条件测定方法的专属性，结果显示渗析液中其他成分对葛根素的测定无干扰；称取葛根素对照品适量，用微透析灌注液配制系列对照品溶液（01，1，5，10，20，50，100，200，400 mg·L-1）考察方法线性关系，葛根素在01～400 mg·L-1线性关系良好，回归方程为y=42 55792x+26 07854 （R2=1000）；高、中、低3个质量浓度（即200，20，1 mg·L-1）的日内精密度分别为026%，032%，048%，日间精密度分别为0050%，0070%，022%。线性范围内高、中、低3个质量浓度（即200，20，1 mg·L-1）的方法回收率分别为9927%，9774%，9748%，方法回收率良好。

23浓差法测定模型药物体外微透析回收率

配制含362 mg·L-1 川芎嗪或512 mg·L-1葛根素的等渗PBS缓冲液（pH=72）置于透皮池内，温度维持在37 ℃，搅拌子转率设置为200 r·min-1。以一系列含不同浓度川芎嗪或葛根素的等渗PBS缓冲液进行灌注，灌注速率为10 μL·min-1，灌注液质量浓度分别为0625，125，25，50，100，200 mg·L-1。每次更换灌注液至少開泵冲洗平衡约1 h才开始收集下一个样品，每30 min收集1次样品，重复收集3次，收集渗析液样品按HPLC方法进行含量测定。

24反向渗析法测定模型药物的探针在体回收率

241微透析探针植入皮下手术过程取SD大鼠，用02 g·mL-1乌来糖按体重（15 g·kg-1，ip）麻醉后，固定于鼠板上，递毛器小心递去腹部毛发；将经皮微透析探针（半透膜长度为10 mm）用引导针穿刺植入大鼠皮下后（穿刺长度保持约30 mm），引导针小心抽回，微透析探针膜留于大鼠皮下组织中；在样品收集前用等渗PBS缓冲液（pH 72）排除探针内气泡，并以流速10 μL·min-1灌注速率平衡1 h。

242探针体内回收率及其稳定性考察配制约为1 mg·L-1川芎嗪或葛根素的等渗PBS（pH 72）药液，将线性微透析探针植入大鼠皮下组织后，以流速为10 μL·min-1灌注药物溶液，每30 min收集渗析液1次，收集600 min，平行重复4次，然后选择建立的HPLC分析方法测定川芎嗪或葛根素含量。

25在体经皮微透析实验

251经皮微透析给药手术取SD大鼠，用02 g·mL-1乌来糖按体重（15 g·kg-1，ip）麻醉后，固定于鼠板上，递毛器小心递去腹部毛发；将经皮微透析探针（半透膜长度为10 mm）用引导针穿刺植入大鼠皮下后（穿刺长度保持约30 mm），引导针小心抽回，微透析探针膜留于大鼠皮下组织中，见图1A；然后取体外透皮试验中的供给池（内径15 mm，外径25 mm），见图1B，用UHU万能胶小心均匀涂抹于供给池下口，将供给池贴于大鼠皮肤，并使导入皮下的探针半透膜区域正好位于供给池正中央；采用等渗PBS缓冲液（pH 72）以100 μL·min-1的灌注速率灌注10 min，排除微透析探针内气泡，然后切换为流速10 μL·min-1灌注速率平衡系统1 h。

252给药方案根据前期体外透皮实验给药方案[45]，采用丙二醇与水的混合溶剂系统（PGH2O 80∶20），配制含20 g·L-1川芎嗪或葛根素的低中高浓度花椒挥发油（即1%，3%，5%），其中，只由溶剂系统配制的川芎嗪或葛根素溶液組作为对照组，并选择常用经典化学促透剂氮酮作为阳性对照。待微透析系统平衡完成后，加入2 mL不同组别的药物溶液，并用封口膜将供给池上口封闭，防止溶液中水分挥发，每组重复4次。从加入药物溶液后开始计时，每30 min收集渗析液样品，共收集600 min，按22项进样测定。

26数据处理与分析

相对回收率（R）是指药物在渗析液中的浓度（Cd）和在组织液中的浓度（Cm）的比值，其一般性定义如下[6]。

R=Cd -CpCm -Cp （1）

其中，Cp为药物在灌注液中的浓度。当药物在灌注液中的药物浓度大于探针周围环境的浓度时，药物则由灌注液进入组织液中，这种条件下所测得的回收率被称为传递率（Loss），如果组织液中药物的浓度相对灌注液中的浓度很低，则可认为Cm为零，传递率可由下式表示。

Loss=Cd-CPCP（2）

根据回收率的定义，用一系列含不同浓度药物的灌注液进行微透析实验，然后以Cd -Cm对Cp作图，则得到一条直线，直线的斜率即为R，横轴上的截距则为Cm；两者可以由线性回归方程分别计算出，这就是用于计算R和Cm的浓差法。但需要注意的是，只有当Cd-Cm>0时，药物由探针周围环境向灌注液扩散，此时R为回收率；当Cd-Cm<0时，灌注液中的药物向周围环境中扩散，这时所求得R为传递率[7]。

将各组渗析液样品利用HPLC进行含量测定，按线性回归方程求算其对应浓度值，根据每组探针对模型药物的在体相对回收率，求算得皮肤组织下药物真实浓度。根据每个时间点内皮肤组织下的药物浓度值和流经探针的渗析体积（即30 μL），计算该时间点内皮肤组织下的药物质量，并计算600 min内药物的累积透过量。

Q=ni=1CiVi（3）

其中，Q（μg）为累积透过量，Ci（mg·L-1）为第i个时间点的皮肤组织下药物浓度，Vi为每个时间点的取样体积（即为003 mL）。以药物累积透过量对时间作图，所得直线部分（480～600 min）的斜率即为稳态透皮速率（Jss，μg·min-1），直线部分反向延长线与X轴的交点即为滞后时间（Tlag，min）[8]。

花椒挥发油的药物促透比（enhancement ratio，ER）按下式计算。

ER=Jss（含促透剂）Jss （不含促透剂）

（4）

3结果

31川芎嗪和葛根素的体外微透析回收率

根据模型药物体外微透析回收率的测定结果，以渗析液和灌注液中川芎嗪浓度差（即渗析液中药物浓度的净增加值）对灌注液中川芎嗪的浓度作图，见图2。图2所示的直线为Cd-Cp=-0816 5Cp+1988 9 （R2=0999 9）。直线与横轴交点处的浓度（244 mg·L-1）即为探针周围浓度中川芎嗪的浓度，与透皮池中实际加入的药物浓度（362 mg·L-1）相差不大，直线的斜率（即探针体外回收率）为（8165±502）%。

根据公式（1）分析，在Cd-Cp对Cp作图中，横轴以上直线部分的斜率为微透析探针回收率，而横轴以下部分的斜率为传递率，由图2，3可知，横轴以下部分与横轴以上部分斜率相等，说明该微透析探针的回收率与传递率对于川芎嗪和葛根素是相等的，表明在等渗PBS缓冲盐溶液中，药物在渗析膜间无相互作用，且经过探针渗析膜正向与反向的扩散相等。

32川芎嗪和葛根素的探针体内回收率及稳定性

根据浓度法结果可知，川芎嗪和葛根素在微透析探针正向与反向扩散速率相等，表明可根据反向渗析法测定微透析探针对2种药物的传递率，计算探针的药物在体回收率，因此，按公式（2）所计算结果即为川芎嗪和葛根素的探针在体回收率，同时考察其在600 min内探针在体回收率的稳定性，结果见图4。由图4所知，川芎嗪的微透析探针在600 min内的体回收率保持在（5917±122）%，葛根素的微透析探针在600 min内的体回收率保持在（1985±160）%，表明两者在600 min内微透析探针的在体回收率稳定。

33花椒挥发油对川芎嗪的在体促透吸收情况

花椒挥发油对川芎嗪透过大鼠皮肤的在体渗透药时曲线见图5，不同时间点对应药物累积透过量见图6，不同促透剂作用下川芎嗪在体透皮吸收参数见表1。由图表可知，在氮酮作用下，不同浓度（低、中和高浓度）氮酮对川芎嗪的在体透皮吸收均具显著促进作用。但是，3%氮酮对川芎嗪的促透倍数为8911，而5%氮酮对川芎嗪的促透倍数为5821，表明当氮酮增加到一定浓度后，其促透倍数有所降低，这与体外透皮试验中氮酮的促透作用趋势相同[4]；而花椒挥发油的在体促透倍数随着挥发油浓度的增加而增加，呈现出浓度依赖性关系，其中，当花椒挥发油应用浓度达到3%时，对川芎嗪的稳态流速表现出显著性差异；而当花椒挥发油的浓度达到5%时，其促透倍数为9864，较氮酮的促透效果更好（3% 氮酮，ER=8911）；同时，该研究结果显示，花椒挥发油对川芎嗪在体透皮吸收的滞后时间有所延长，与化学促透剂氮酮相似。

34花椒挥发油对葛根素的在体促透吸收情况

花椒挥发油对葛根素透过大鼠皮肤的在体渗透药时曲线见图7，不同时间点对应药物累积透过量见图8，不同促透剂作用下葛根素在體透皮吸收参数见表2。由于采用HPLC未能有效的检测出对照组葛根素的药物含量，因此，不能有效反映出在应用促透剂后的促透倍数，这与葛根素亲水性和较低的在体回收率有关。但从葛根素的经皮稳态流速可知，在应用不同浓度氮酮后，其经皮稳态流速明显增加。同时，随着氮酮应用浓度的进一步增加，其对葛根素的经皮促透效果有所下降，这与课题组前期的体外透皮试验结果一致[9]。而在花椒挥发油作用下，随着挥发油浓度的不断增加，对葛根素的经皮稳态流速明显增加，并表现出浓度依赖性关系。

4讨论

经皮微透析技术对药物选择性较高，并不适合于大量且较大极性范围药物的经皮吸收实验。因此，本研究根据前期体外透皮试验系列不同极性模型药物的选择，选择药物极性相对适宜的偏亲脂性药物的川芎嗪和偏亲水性药物葛根素为代表，从而评价花椒挥发油的在体经皮促透特征。

在经皮微透析的体内药动学研究中，探针的相对回收率是求算皮肤组织中药物含量的重要参数。该实验考查灌注流速对探针回收率的影响，选择了灌注流速为10 μL·min-1进行经皮微透析实验，既满足了探针相对回收率要求，又保证有足量的渗析液样品可用于药物含量测定。同时，温度、药物的性质、灌注液的组成也影响探针的回收率，本实验的温度值固定为37 ℃，灌注液也尽量接近皮下真实环境条件确定为等渗PBS缓冲溶液。

大量定量结构渗透性关系（quantitative structurepermeation relationship，QSPRs）研究显示[910]，药物的油水分配系数（lgP）是影响药物皮肤通透性的主要理化参数，药物的皮肤通透性与药物的lgP值呈现抛物线关系，通常lgP在2～3的药物经皮渗透性较好，即具适宜亲脂性药物的经皮透过性较好，亲脂性过强或亲水性药物透皮吸收较差。本实验中川芎嗪的适宜亲脂性使其在未加促透剂条件下即有较好的透皮吸收，而葛根素为亲水性药物，药物自身透皮吸收较差，加之微透析探针回收率也因其亲水性而较低，因此，在未加入促透剂的正常条件下难以有效检测其透皮吸收含量。但花椒挥发油的加入，葛根素的在体透过量增加明显，这表明花椒挥发油对葛根素良好的经皮促透效果。同时，与前期体外透皮试验的经皮促透相比[4]，在体与体外ER的相关性较好。

与化学促透剂氮酮相比，虽然低浓度的花椒挥发油对2种模型药物在体经皮促透倍数较低，但随挥发油应用浓度的增加，对药物的促透倍数增加明显，而氮酮则随浓度增加表现出先增加后逐渐降低的趋势，这与花椒油和氮酮对皮肤结构作用机制有关，也与两种促透剂的脂溶性有关，从而改变了药物的热力学活性[45]。

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[责任编辑孔晶晶]