黄芪丹参水煎液抑制ISO诱导的大鼠心肌重构及其下调STIM1 TRPC1 CaN和NFATc3表达的机制

王新东　祁晓霞　卞勇　陈晓栋　张一炎　方祝元

[摘要]探討黄芪丹参水煎液（HDD）对异丙肾上腺素（ISO）诱导大鼠心肌重构抑制作用和对STIM1，TRPC1，CaM，CaN，NFATc3表达的影响。 皮下注射 ISO（25 mg·kg-1·d-1，14 d）建立大鼠心肌重构模型，随机分为对照组、ISO模型组、HDD5（HDD 5 g·kg-1·d-1+ISO）组、HDD10（HDD 10 mg·kg-1·d-1+ISO）组。干预4周后，计算心脏质量指数（HW/BW）和左心室质量指数（LVW/BW）；超声心动图观察心肌结构；HE染色观察心肌组织病理学结构变化；ELISA检测血清中 BNP，CaN和CaM kinases Ⅱ的水平；Western blot检测左心室组织 STIM1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3蛋白的表达。结果显示，ISO组大鼠HW/BW和LVW/BW均大于HDD5组和HDD10组（P<005）；超声心动图检查结果显示，HDD能够抑制 ISO诱导的LVEDD，LVESD增加；ELISA检测显示，HDD能明显抑制ISO致心肌重构大鼠血清中BNP，CaN和CaM kinases Ⅱ含量的升高（P<001）。Western blot 检测结果显示，ISO组大鼠心肌组织STIM1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3表达升高，HDD给药后心肌组织内STIM1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3的表达均降低（P<005）。 结果表明，黄芪丹参水煎液具有抑制ISO致大鼠心肌重构的作用，其机制与下调STIM1，TRPC1，CaM kinases Ⅱ，pCaN/CaN和pNFATc3/NFATc3表达有关。

[关键词]黄芪丹参水煎液； 心肌重构； 基质相互作用分子1； 瞬时受体电位通道1

[Abstract]To investigate the inhibitory effect of Huangqi Danshen decoction （HDD） on isoproterenol （ISO）induced myocardial remodeling and explore its effect on STIM1， TRPC1， CaN and NFATc3 expressions ISO （25 mg·kg-1·d-1×14 d） was given by subcutaneous injection to establish myocardial remodeling models in rats， and then were randomly divided into control group， ISO model group， HDD5 group （HDD 5 g·kg-1·d-1+ISO）， and HDD10 group （HDD 10 g·kg-1·d-1+ISO） After intervention for 4 weeks， the heart mass index （HW/BW） and the left ventricular mass index （LVW/BW） were calculated； the structure of myocardium was observed by echocardiography； the pathological changes of myocardium were observed by HE staining； levels of BNP， CaN and CaM kinases II in serum were detected by ELISA， and the protein expression levels of STIM1， TRPC1， pCaN， pNFATc3， and NFATc3 in left ventricular tissues were detected by Western blot The results showed that the HW/BW and LVW/BW in ISO group were greater than those in HDD5 group and HDD10 group （P<005）； Echocardiography showed that HDD inhibited ISOinduced increase in LVEDD and LVESD； ELISA results showed that HDD could significantly inhibit the increase of BNP， CaN and CaM kinases II levels in serum of rats with ISOinduced myocardial remodeling （P<001） Western blot results showed that STIM1， TRPC1， pCaN， pNFATc3 and NFATc3 expression levels were increased in the myocardial tissues of ISO group rats， and after HDD administration， the above expression levels were decreased in group ISO， HDD for myocardial tissue after administration of STIM1， TRPC1， pCaN， pNFATc3 and NFATc3 expression decreased （P<005） Our findings indicated that HDD can attenuate the myocardial remodeling induced by ISO， and its mechanism may be related to downregulating the expression levels of STIM1， TRPC1， CaM kinases II， pCaN/CaN and pNFATc3/NFATc3

[Key words]Huangqi Danshen decoction； myocardial remodeling； STIM1； TRPC1

随着冠心病介入治疗的发展，越来越多的冠心病患者可以从急、慢性心肌缺血事件中存活下来，但继发于缺血所导致的缺血性心肌重构进而进展为心力衰竭严重影响患者的晚期寿命和生活质量，其治疗仍然是尚未攻克的难题。目前临床常规采用的抗心室重构治疗主要有应用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）和长效β受体阻滞剂等，但在实际的临床中常规抗心室重构治疗在改善左室重构方面并不是很有效，根据REVE（Remodelage Ventriculaire）研究组的调查，常规抗心室重构治疗后仍有31%患者在心梗后1年内发生明显左室重构[1]。大量的临床研究显示中药益气活血治法对缺血后的心室重构有明确疗效。中药黄芪和丹参药物组合是益气活血治法的代表药物，在中医药治疗心力衰竭心室重構中有着广泛应用。根据现代药理学的研究结果，黄芪和丹参中的多种有效成分如黄芪皂苷Ⅳ和丹参酮ⅡA均有Ca2+拮抗的类似作用[23]。笔者前期应用UFLCQTOF/MS法对黄芪丹参水煎液（Huangqi Danshen decoction，HDD）的主要成分做了分析显示，HDD中含有以黄芪皂苷Ⅳ、丹参酮ⅡA为主的28种成分[4]。研究显示钙库操控性钙通道（store operate calcium channel，SOCC）与缺血性心肌重构的发生和发展密切相关，可能是防治缺血性心血管病的新靶点[5]。SOCC主要由基质相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）、Orai 及经典瞬时受体电位通道（transient receptor potential channel，TRPC）家族组成。本研究观察了黄芪丹参水煎液对异丙肾上腺素（ISO）诱导的大鼠心肌重构的抑制作用和对STIM1，TRPC1，钙调蛋白激酶（calmodulindependent protein kinase，CaM kinases ）Ⅱ，钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）/pCaN和活化T细胞核因子（nuclear factor of activated Tcells，NFATc）3/pNFATc3表达的影响，探讨其抗重构效应的可靠性和作用机制，为其临床应用提供依据。

1材料

11动物雄性SpragueDawley大鼠40只，清洁级，体重180～210 g，南京中医药大学实验动物中心提供，置于清洁、恒温环境中，采用人工照明，每天白天与夜间各12 h分笼饲养，予以标准饲料，自由取食及取水。

12药物与试剂精确称取内蒙古产道地黄芪饮片200 g、莒县产丹参饮片100 g，置煎药砂锅内，加800 mL蒸馏水浸泡2 h，武火煎煮至沸腾调至文火保持微沸l h，16层纱布过滤，收集滤液，滤渣加800 mL蒸馏水，武火煎煮至沸腾调至文火保持微沸l h，16层纱布过滤，收集滤液，合并2次滤液，浓缩药液至300 mL，则生药质量浓度为1 g·mL-1，置4 ℃保存。使用时根据需要稀释至相应浓度，给予大鼠灌胃。

盐酸异丙肾上腺素（SigmaAldrich，USA）；大鼠BNP酶联免疫试剂盒（PL Laboratories Inc，Canada）；大鼠CaN酶联免疫试剂盒（PL Laboratories Inc，Canada）；大鼠CaM kinases Ⅱ酶联免疫试剂盒（PL Laboratories Inc，Canada）；兔抗 STIM1多克隆抗体（Cell Signaling Technology，USA）；兔抗TRPC1多克隆抗体（Cell Signaling Technology，USA）；鼠抗 PanCalcineurin A单克隆抗体（Abcam，USA）；鼠抗NFATc3单克隆抗体（Santa Cruz，USA）；兔抗 pNFATc3多克隆抗体（Santa Cruz，USA）。

13仪器VIVIDQ型超声心动仪及5～12 MHz高频线控探头（GE公司，USA）；全自动酶标仪（宝特，USA）；Mini protein3 电泳装置（BioRad 公司，USA）。

2方法

21大鼠心肌重构模型建立、分组与干预方法通过ISO皮下注射诱导建立缺血性心肌重构模型。SD大鼠随机分为4组：对照组（Control，n=10）、ISO模型组（ISO，n=10）、黄芪丹参水煎液5 g·kg-1·d-1组（HDD5，n=10）、黄芪丹参水煎液10 g·kg-1·d-1组（HDD10，n=10）。

Control组给予皮下缓慢注射生理盐水03 mL·d-1，连续28 d。ISO组给予皮下缓慢注射ISO 25 mg·kg-1·d-1，连续14 d；同时灌服生理盐水2 mL·d-1，每日1次，连续28 d。HDD5组给予皮下缓慢注射ISO 25 mg · kg-1· d-1，连续14 d；同时灌服黄芪丹参水煎液5 g · kg-1，每日1次，连续28 d。HDD10组给予皮下缓慢注射ISO 25 mg · kg-1· d-1，连续14 d，同时灌服黄芪丹参水煎液10 g · kg-1，每日1次，连续28 d。

22超声心动图检测心肌结构28 d末4组大鼠以03%戊巴比妥钠腹腔注射诱导麻醉后备皮，使用超声系统进行经胸超声心动图。在乳头肌水平的短轴切面中获得二维引导的M模式图像，M模式的扫描速度为200 mm·s-1。检测左心室收缩末期直径（left ventricular endsystolic diameter，LVESD），左心室舒张末期直径（left ventricular enddiastolic diameter，LVEDD），左心室舒张末期容积（left ventricular enddiastolic volume，LVEDV），左心室后壁（left ventricular posterior wall，LVPW），室间隔厚度（IVS，interventricular septum）。然后，使用以下等式从M模式计算射血分数（ejection fraction，EF）和短轴收缩率（fractional shortening，FS）：EF= [（LVEDV-LVESV）/LVEDV]×100%，FS= [（LVEDD-LVESD）/LVEDD]×100%。

23左心室质量指数和心脏质量指数测定生理盐水反复灌洗心脏后剥离心脏，剪去周围结缔组织和血管，滤纸吸干水后，电子天平秤量心脏湿质量（HW），剪去心房和右心室游离壁，秤量左心室湿质量（LVW），计算心脏质量指数=心脏湿质量/体重（HW/ BW）；左心室质量指数=左心室湿质量/体重（LVW/ BW）。

24ELISA检测血清BNP，CaN，CaM kinases Ⅱ水平经腹主动脉插管抽血 4 mL，4 ℃，3 000 r·min-1，离心10 min，分离血清，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定B型尿钠肽（B type urinary natriuretic peptide，BNP），CaN，CaM kinases Ⅱ含量，均按相关说明书操作。

25大鼠心尖组织病理学检测大鼠心尖部组织取材后置于4%多聚甲醛固定液中浸泡固定24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，制作4 μm切片，苏木素伊红（H&E）染色处理，中性树脂封片，光学显微镜下观察并采集图片。采用盲法，从心肌变性坏死、间质纤维增生、心肌细胞空泡变性和间质炎细胞浸润4个方面对心肌损害程度进行观察与等级分类，每张片子至少观察5个视野，其分级标准：–，无异常发现；+，轻度损伤；，中度损伤；，重度损伤。

26Western blot检测左室心肌组织STIM1，TRPC1，pCaN，NFATc3，pNFATc3蛋白的表达取左心室组织约100 mg，加RIPA裂解缓冲液1 mL 匀浆，离心取上清液进行蛋白定量。取40 μg 蛋白经聚丙烯酰胺变性凝胶分离，电转膜法转移到PVDF 膜上。封闭、分别加STIM1，TRPC1，pCaN，NFATc3，pNFATc3一抗（1∶200稀释）、辣根过氧化物酶标记二抗，二氨基联苯胺显色，凝胶成像系统分析。

27统计学方法应用SPSS 21 0 软件进行分析，各组计量资料以±s表示，多组间均数比较采用Oneway ANOVA分析，两两比较用LSDt 检验，P<005 为差异有统计学意义。

3结果

31HDD对ISO大鼠HW/BW和LVW/BW的影响接受ISO皮下注射的3组大鼠HW/BW和LVW/BW较对照组增大，ISO组大鼠HW/BW和LVW/BW均大于HDD5组和HDD10组，与ISO组相比HDD10组HW/BW和LVW/BW更低（P<005），提示HDD能够抑制 ISO导致的心脏和心室增大，见表1。

32HDD对ISO大鼠心脏组织形态学影响心肌组织病理切片H&E染色结果显示：Control组大鼠心肌组织无异常改变，心肌细胞结构完整，心肌纤维横纹清晰规整，间质未见炎性细胞的浸润；ISO组大鼠心肌结构紊乱，间质可见不同程度的局灶性或

大片状细胞坏死，并可见较多炎性细胞浸润及间质性水肿；与ISO组比较，HDD5和HDD10呈现小范围的心肌坏死、纤维化，伴少量炎性细胞浸润和间质水肿。提示HDD不同程度减轻了大鼠心肌坏死等组织形态学结构的异常改变。病理等级分类结果更进一步证明了HDD对 ISO 致大鼠心肌重构的心肌形态结构具有很好的保护作用，见图1和表2。

33HDD对ISO大鼠心脏结构和功能的影响超声心动图显示，与Control组相比，ISO组大鼠的EF和FS值显着降低（P<001），LVEDD值增加（P<001）和LVESD值增加（P<005），表明左心室明顯增大、心功能下降。与ISO对照组相比，HDD10组LVEDD和LVESD值明显降低（P<005），见表3。

35HDD对STIMI1，TRPC1，pCaN，pNFATc3和NFATc3蛋白表达的影响与Control组相比，ISO组STIM1表达水平升高；与ISO组相比，HDD5和HDD10组STIM1表达水平明显下降（P<001）。与ISO组相比，HDD5和HDD10组TRPC1表达水平均下降，但HDD10组下降更明显（P<001）。与Control组相比，ISO组pCaN，pNFATc3和NFATc3表达水平升高；与ISO组相比，HDD5和HDD10组pCaN，pNFATc3和NFATc3表达水平均下降，但HDD10组下降更明显（P<005），见图2。

4讨论

心肌重构是由于心肌缺血或血液动力学紊乱诱发心肌肥大基因转录和蛋白表达的异常，导致心肌结构和心脏功能发生变化，其病理表现以心肌细胞体积增大、间质纤维化、间质炎细胞浸润水肿和肌小节重构为主要特征，是心力衰竭发生发展的基本机制。ISO可兴奋心脏β1受体引起心率加快、心肌收缩力增加、心肌耗氧量增加。本研究结果显示，25 mg·kg-1 ISO皮下注射引起了大鼠心肌肥大和重构，表现为HB/WB和LVB/WB增加，光镜下大范围的心肌细胞肥大、弥漫性片状坏死、间质纤维化、炎细胞浸润和间质水肿为主要表现，超声心动图显示心脏扩大、心肌肥厚、EF降低，而HDD能够抑制抑制IOS 引起的大鼠心肌肥大。病理结果也显示，HDD能够减轻ISO致大鼠心肌组织病理学结构的异常改变，且与剂量相关，此研究结果提示HDD对ISO致大鼠心肌肥厚的心肌组织形态结构具有保护作用，且高剂量HDD给药组对心肌肥大和心肌坏死的抑制作用强于低剂量HDD给药组，而病理等级分类结果进一步证明了HDD的抗重构效应。此研究结果为HDD对ISO所致慢性大鼠心肌重构的抑制作用提供了形态学和功能学证据。

BNP是一种心血管肽类激素，参与了心衰发生、发展的病理过程，其反映心力衰竭程度的敏感性和特异性均较高。本研究结果显示，接受ISO皮下注射后大鼠血清BNP均不同程度的升高，提示存在心力衰竭。而给予HDD干预后BNP升高的幅度明显低于对照组，反映了HDD对心功能的改善作用，BNP的检测结果从体内激素水平的角度进一步印证了HDD可改善ISO导致的心肌重构、心功能下降。

STIM1是SOCC的感受器，TRPC是SOCC开放的门户，TRPC 1亚型在大鼠和人类心脏中均有表达[6]。研究显示使用硝苯地平抑制电压依赖性钙通道（voltage dependent calcium channel，VDCC）通道后，心肌肥大并没有得到改善，而采用SOCC阻断剂SKF96365或敲除SOCC基因后，心肌肥大能得到明显改善[7]，提示SOCC引起Ca2+内流在心肌肥大过程中扮演了重要的角色。本研究结果显示，单纯接受ISO皮下注射后STIM1，TRPC1蛋白表达水平上调，而HDD能够下调ISO导致的STIM1和TRPC1表达水平升高，此结果提示 HDD改善心肌重构的作用可能与下调STIM1和TRPC1表达从而抑制Ca2+内流相关。

CaM/CaN/NFATc3也参与心肌重构的病理发展过程。不同来源的胞浆Ca2+与胞浆内CaM结合后形成的Ca2+CaM复合物激活依耐赖钙调素的蛋白激酶使底物磷酸化从而发挥调节作用，这种底物包括各种酶、骨架蛋白、离子通道及转录因子等。CaN在细胞信号传递过程中接受 Ca2+的调节，起去磷酸化作用，参与多种细胞功能调节[8]。NFATc是CaN最重要的底物，Ca2+CaM复合物通过激活CaN，影响着NFATc活性。胞浆中的 CaN活化后使胞浆的 NFATc 去磷酸化和核内转位，进入核内的去磷酸化NFATc与心肌细胞核内的转录因子相互作用，活化多种心肌肥大的相关基因如心房利钠肽等基因表达，使细胞内的蛋白合成增多，细胞体积增大，诱导心肌肥大，最终导致病理性心肌肥厚[9]。本研究显示，单纯接受ISO皮下注射后心肌pCaN，pNFATc3/NFATc3和血清CaN，CaM kinases Ⅱ表达水平均上调，而 HDD能够下调ISO 导致的pCaN/CaN，pNFATc3/NFATc3和CaM kinases Ⅱ表达升高，此结果提示 HDD改善心肌重构的机制可能与下调pCaN/CaN，pNFATc3/NFATc3和CaM kinases Ⅱ相关。

已有的研究表明，TRPC基因本身就可以对CaN/NFAT信号通路进行正反馈调节，当TRPC基因表达下降时，就会下调CaN/NFATc信号通路的表达导致了进入核内的去磷酸化NFATc减少，从而就抑制了心肌细胞多个肥大基因的表达，完成心肌肥厚的逆转；另外，结构上TRPC基因位于NFATc基因的下游，当NFAT基因表达下降时，也能抑制TRPC基因表达，这样就完成TRPCCaN/NFATc正反馈循环的调节[10]。从本研究的结果可以推测HDD对TRPCCaN/NFATc正反馈循环也具有调节作用。综合本研究结果，HDD 具有明确的改善心肌重构的作用，其机制可能与下调 STIM1，TRPC1，CaM kinases Ⅱ，CaN，NFATc3的表达有关。

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[责任编辑张宁宁]