中药降糖复方水提取物对KKAy糖尿病小鼠糖基化终末端产物及氧化应激的影响

洪金妮　黎巍威　富宏　王学美

[摘要]研究中药降糖复方水提取物对KKAy小鼠AGEs和RAGE的影響。将自发性2型糖尿病模型KKAy小鼠随机分成5组：模型组、二甲双胍组、中药降糖复方低、中、高剂量组。另外，C57BL/6J小鼠作为正常对照组。其中二甲双胍组灌胃盐酸二甲双胍250 mg·kg-1；中药降糖复方低、中、高剂量组分别灌胃水提取物2，4，8 g·kg-1；正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次，共12周。实验过程中分别对小鼠血清中及（或）尿液中的谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酐（creatinine，Cr）、血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）、糖基化终末端产物（advanced glycation end products，AGEs）及糖基化终末端产物受体（receptor of glycation end products，RAGE）等进行检测。于灌胃12周后处死小鼠，取小鼠肾脏做病理切片及免疫组化，同时取肾组织做蛋白印记法Western blot、荧光实时定量PCR、酶联免疫吸附测定法ELISA检测AGEs，RAGE，过氧化氢酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等氧化应激指标。该研究证实中药降糖复方水提取物能在一定程度上改善KKAy小鼠肾功能（P<005），缓解糖尿病肾病，猜测其机制可能与降低体内AGEs和RAGE，抑制氧化应激有关。

[关键词]2型糖尿病； 糖基化终末端产物； 糖基化终末端产物受体； 氧化应激

[Abstract]To elucidate the efficacy of Jiangtang decoction（JTD） on AGEsRAGE and oxidative stress in type 2 diabetic model KKAy mice Fifty KKAy mice were randomly divided into 5 groups as follows： model group， metformin group， lowdose， mediumdose and highdose of JTD group， with 10 C57BL/6J as normal group All groups are orally administrated with equal distilled water， 250 mg·kg-1metformin hydrochloride， 2， 4，8 g·kg-1JTD， equal distilled water respectively， once per day for 12 weeks Alanine aminotransferase（ALT）， creatinine（CREA）， urea nitrogen（BUN），advanced glycation end products（AGEs） and receptor of glycation end products（RAGE） in blood or urine were measured during the experiments Furthermore， on the day of the sacrifice， kidney was collected， and electronic microscopy and immunohistochemistry were performed to evaluate the protective renal effect of JTD In addition， the levels of AGEs， RAGE， Catalase（CAT） and superoxide dismutase（SOD） were assessed by Western blot， Realtime PCR or ELISA to analyze the efficacy of JTD This study demonstrated that JTD might protect kidney of KKAy by downregulating the expression of AGEs， RAGE and oxidative stress

[Key words]type 2 diabetes； AGEs； RAGE； oxidative stress

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是继心血管疾病和肿瘤之后第三大非传染性疾病，其并发症遍及全身各个器官。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，在我国发生率高达25%～40%[1]，但其治疗手段仍十分有限。中药降糖复方是北大医院王学美教授临床上治疗T2DM的常用方，由地锦草、黄连、黄芪、丹参、知母等配伍组成，清热活血、益气养阴。前期临床研究发现该方可有效降低患者空腹及餐后血糖，降低患者尿蛋白，减少西药服用量，服用安全。但中药降糖复方是否能够改善肾功能，及其中的机制有待进一步研究。本文通过研究中药降糖复方水提取物对KKAy小鼠血尿液生化，AGEs，RAGE，氧化应激指标及肾脏病理等的影响，探讨其对2型糖尿病引起的糖尿病肾病的疗效及作用机制，为中药降糖复方的研发提供思路。

1材料

11动物健康C57BL/6J小鼠10只，雄性，9周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）20120001；自发2型糖尿病模型KKAy小鼠50只，雄性，9周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）20140004。C57BL/6J小鼠普通饲料饲养；KKAy小鼠高脂饲料饲养，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）20140008。所有动物均自由饮水，在室温（22±1） ℃，12 h光照周期，SPF环境中适应性饲养1周。尾尖取血测小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥70 mmol·L-1或随机血糖≥111 mmol·L-1或即视为糖尿病模型。

12药物地锦草Euphorbiae Humifusae Herba，丹參Salvia miltiorrhiza，生黄芪Astragali Radix，知母Anemarrhena asphodeloides Bge，黄连Coptidis Rhizoma生药均购自北京大学第一医院中药房。药物比例为3∶4∶2∶2∶1，取处方量药材，加7倍量水，浸泡1 h，加热回流提取2次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩，干燥，得到水提取物。用双蒸水配置成生药浓度为生药02，04，08 g·mL-1备用。取盐酸二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）1 g溶于40 mL双蒸水中，制成25 g·L-1的阳性给药液，灌胃体积均为001 mL·g-1体重。

13试剂及仪器糖基化终末端产物AGEs酶联免疫检测试剂盒（abbexa，abx054078，批号L201610A346）；糖基化终末端产物受体RAGE酶联免疫检测试剂盒（R&D，MRG00，批号P103593）；AGEs抗体（abcam，ab23722，批号GR2867061）；RAGE抗体（abcam，ab3611，批号GR2887402）；GAPDH（北京中杉金桥生物技术有限公司，TA08，批号16AF0411）；兔抗山羊二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，L3032，批号8715）；鼠抗山羊二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，L3012，批号8715）；Trizol （ambion，15596018，批号144303） ；cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，4368814，批号00463285）；第一链cDNA合成试剂盒（ Thermo scientific，4472908，批号1610048）；7500实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）；Infinite M200酶标仪（瑞士TECAN公司）；VELOCITY18R型离心机（澳大利亚 Dynamica公司）；MB1002A型微孔板恒温振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；ES1100（长沙湘平科技发展有限公司）；OLYMPUS DP70纤维数码相机（日本PLYMPUS公司）；日立7180生化全自动分析仪；日立7600生化全自动分析仪。

2方法

21分组及给药将KKAy小鼠随机分成5组，分别为模型组、二甲双胍组、中药降糖复方低、中、高剂量组，每组10只，以C57BL/6J小鼠为正常对照组。其中二甲双胍组灌胃盐酸二甲双胍（250 mg·kg-1体重），中药低、中、高剂量组分别按2，4，8 g·kg-1体重灌胃中药降糖复方水提取物。正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次，共12周。

22血样收集及检测给药12周后，小鼠内眦取血，用ELISA法检测血清中AGEs和RAGE的含量，按照相关说明书操作；血清送到北京大学第一医院检验科，采用日立7180全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶含量。

23尿样收集及检测收集小鼠24 h尿液，4 500 r·min-1离心10 min，送到北京大学第一医院检验科，采用日立7180全自动生化分析仪和日立7600全自动生化分析仪检测尿肌酐、尿素氮、尿微球蛋白。

24肾脏病理检查（电镜和免疫组化）灌胃12周后，动物处死，取小鼠一侧肾皮质放置于3%戊二醛固定，送到北京大学第一医院电镜室做病理切片；取另一部分肾脏，4 ℃生理盐水冲洗，10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，梯度脱蜡至水，随后做AGEs和RAGE染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用Olympus DY07显微镜观察肾脏形态学变化。

25Western blot检测肾脏组织中AGEs和RAGE蛋白表达取100 mg肾脏加入1 mL蛋白裂解液，于冰上充分研磨混匀，进行蛋白定量，并配平。取蛋白样品15 μL，在电泳槽中进行聚丙烯酰胺电泳，电转膜至PVDF膜上。5%PBS封闭1 h，加入相对应的一抗，其中AGEs和RAGE均是1∶1 000稀释，GAPDH 1∶1 500稀释，于4 ℃摇床中过夜，TBST洗膜10 min/次×3次，二抗室温摇床孵育2 h，TBST再次洗膜10 min/次×3次，化学发光法成像。蛋白含量用Image J软件进行定量分析，以AGEs/GAPDH和RAGE/GAPDH表示蛋白相对表达量。

26实时荧光定量PCR检测肾脏组织中RAGE，SOD和CAT mRNA的表达用Trizol提取肾脏组织中的总RNA，用逆转录试剂盒逆转成cDNA，用7500实时荧光定量PCR系统进行实时定量，反应体系如下：SYBR Green mix 10 μL，双蒸水8 μL，上下游引物各05 μL，反转录产物10 μL。扩增反应程序设置如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 30 s，40个循环，重复5次。将待测基因与内参GAPDH的比值的均数作为待测基因mRNA的相对表达量，结果采用2ΔΔCt计算。引物序列见表1。

27统计学方法采用SPSS 200软件进行统计分析。实验数据用±s表示，计量资料采用单因素方差分析并做多重比较，P<005为具有统计学差异。

3结果

31通过电镜观察中药降糖复方对肾脏的影响通过电镜（×1万）可以观察到，正常对照组的基底膜（白色箭头）较完整，足突细胞（黑色箭头）排列较整齐，足突细胞融合面积较小；模型组中可见基底膜结构不完整，足突细胞排列非常不整齐，同时出现大面积融合；而阳性药组及各给药组可见，与模型组相比，基底膜相对完整，足突细胞排列相对整齐，足突融合面积较小，见图1。给药12周后，复方能在一定程度上缓解基底膜增厚，且成一定的浓度依赖性。说明中药降糖复方在一定程度上能改善肾组织形态学，见表2。

32对KKAy小鼠肝肾功能的影响所有入选KKAy小鼠均已成模，模型组的KKAy的血糖在造模成功后一直处于高血糖状态。与对照组相比，给药组对小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）的影响没有显著性差异，说明药物无明显的肝功能损害，见图2A。与对照组相比，给药12周后，二甲双胍及各中药组均能在一定程度上降低尿液中的尿素氮，其中中药低浓度的效果最好（P<001），见图2B；与对照组相比，给药12周后，中药给药组能降低尿中的肌酐值，且低浓度和高浓度中药组的效果优于二甲双胍组（P<005），见图2C；与对照组相比，给药12周后，二甲双胍及各给药组均能降低小鼠尿液中的微球蛋白/肌酐比值，且差异具有统计学意义（P<0001），见图2D。综上，说明中药降糖复方水提取物无明显的肝功能损害，能在一定程度上改善KKAy糖尿病小鼠的肾功能。

33通过免疫组化观察中药降糖复方对肾脏中AGEs和RAGE沉积的影响通过AGEs染色，可观察到模型组中肾小球可见大量AGEs沉积，在肾小管也可见部分沉积，而正常对照组和给药组中，AGEs沉积情况相对缓解，见图3A；通过计算发现，与模型组相比，中药降糖复方各组AGEs阳性率较低，具有统计学差异（P<0001），见图3B。通过RAGE染色，可观察到模型组中RAGE在肾小管大量沉积，在肾小球也可见部分沉积，而正常对照组和给药组中RAGE沉积情况相对缓解，见图3A；通过Imageproplus软件计算光密度平均值发现，给药后中药降糖复方各组RAGE阳性率较模型组有所降低（P<0001），且成一定剂量依赖性，见图3C。说明中药降糖复方水提取物能在一定程度上减少糖尿病肾病小鼠肾脏中AGEs及RAGE沉积。

34中药降糖复方对KKAy小鼠血清及肾组织中AGEs和RAGE的影响通过ELISA可见，与对照组相比，在给药12周后，二甲双胍及各给药组均能降低血清中的AGEs含量，且差异具有统计学意义（P<0001，P<001），见图4A；给药12周后，二甲双胍及各给药组均能降低肾组织中的AGEs含量，且降低效果成一定浓度梯度（P<001，P<005），见图4C。与对照组相比，在给药12周后，二甲双胍及各给药组均能降低血清及肾组织中的RAGE含量，见图4B，D，其中中药中剂量、高剂量对血清中RAGE的影响的差异具有统计学意义（P<005）。综上可见中药降糖复方能在一定程度上降低KKAy小鼠血清及肾组织中AGEs和RAGE。

进一步，通过Western blot和荧光实时定量PCR发现，与对照组相比，在给药12周后，二甲双胍及各给药组均能明显降低肾脏组织中AGEs/GAPDH，差异成一定浓度梯度，且具有统计学意义（P<0001），见图5B；二甲双胍及各给药组也能降低肾脏组织中RAGE/GAPDH，低剂量组具有统计学差异（P<005），见图5C；进一步通过实时定量PCR检测证实，二甲双胍及各给药组也能降低肾脏组织中RAGE/GAPDH mRNA（P<0001），见图5D。综上可见，中药降糖复方给药12周能有效降低KKAy糖尿病小鼠血清及腎组织中的AGEs及RAGE含量。

35中药降糖复方对KKAy小鼠SOD和CAT等氧化应激指标的影响通过荧光实时定量PCR检测小鼠肾脏组织的SOD和CAT等抗氧化指标发现，与对照组相比，模型组SOD和CAT mRNA明显

下降。与模型组相比，给药12周后，二甲双胍及各给药组能在一定程度上上调小鼠的SOD和CAT mRNA水平，且成一定的剂量依赖性，见图6。

4讨论

DN是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，其发病机制复杂，AGEs途径是糖尿病的经典学说之一。已知葡萄糖可与各种蛋白质通过非酶促糖基化反应生成AGEs。近年来研究认为肾脏局部堆积的AGEs可通过多种途径，直接和间接参与DN的发生发展。一方面AGEs与其受体RAGE结合可以改变蛋白结构功能，降低酶活性，引起基质蛋白交叉连接，导致肾脏细胞功能异常、组织结构异常，另一方面AGEs与受体RAGE结合后可通过激活NFκB信号通路引起炎症因子如IL6，TNFα等的释放，损伤肾脏组织。在糖尿病患者的肾脏中AGEs的大量聚集，刺激系膜细胞表面的AGEs 受体，使层黏连蛋白及其他肾小球系膜结构蛋白明显增加，最终致系膜区扩张，肾小球基膜增厚，加速肾小球硬化。

可见AGEs和RAGE在糖尿病肾病病理发展过程中发挥着重要作用[2]。目前研究认为氧化应激反应和活性氧簇增多在DN的发生发展中起到重要作用。2003年韩国汉城举行的“活性氧和糖尿病肾病 DN”专题论坛中提出糖尿病并发症的统一机制学说[3]，认为经典的糖尿病并发症的多元醇途径、AGEs途径、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）途径和氨基己糖途径均是高糖环境下线粒体呼吸链中氧自由基生成过多的结果，即氧化应激是高糖损伤的共同基础。

DN治疗手段十分有限，主要通过控制饮食、控制血糖血脂血压、使用血管紧张素酶抑制剂/血管紧张素受体阻滞剂等，延缓疾病进展效果有限，DN是导致终末期肾衰竭的首要原因之一[4]。现代医学证实，炎症因子及促炎因子与DN的发病过程密切相关，并认为DN是一种炎症性疾病[5]。清热解毒中药可能通过抑制炎症因子，AGEs，RAGE，改善脂代谢紊乱，进而降低血糖、改善DN症状、保护肾功能，改善微循环[67]。近年来，随着2型糖尿病炎症机制研究的不断深入，其“热毒”病机与清热解毒治法在临床中的应用得到重视，以刘完素、施今墨为代表的等大家均重视应用清热解毒法治疗糖尿病[89]。中药降糖复方以“热毒”立论，由地锦草、丹参、黄芪、黄连、知母等中药组方，清热活血、益气养阴，其中地锦草性平，味辛微苦涩，清热解毒，利湿降浊，活血凉血，与黄连共为君药；丹参为臣，活血散瘀，清心除烦，辅君降浊化瘀；知母清热养阴，黄芪补脾益气，共为佐使。

本研究通过动物实验，观察中药降糖复方水提取物对自发2型糖尿病KKAy小鼠肾功能，肾脏形态学，AGEs，RAGE，CAT，SOD等氧化应激指标的影响。实验结果显示，中药降糖复方水提取物无明显的肝功能损害，能在一定程度上改善KKAy小鼠血清和尿液中肌酐、尿素氮、微球蛋白/肌酐比值等肾脏相关指标，同时通过电镜发现中药降糖复方能在一定程度上缓解足细胞坏死、结构紊乱，改善基底膜增厚，通过免疫组化发现复方能减少肾脏组织中AGEs和RAGE的沉积，同时上调组织中CAT，SOD等抗氧化应激指标mRNA的表达，提示中药降糖复方水提取物可改善KKAy小鼠糖尿病肾病的机制可能与降低体内AGEs和RAGE，抑制氧化应激反应有关。

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[责任编辑张宁宁]