黄藤中巴马汀与药根碱在大鼠体内药动学及口服生物利用度的研究

郑京玉　李国峰　何忠梅　祝洪艳　赵岩　郜玉钢　杨鹤　张连学

[摘要]该文通过灌胃和尾静脉2种方式对大鼠给予黄藤总生物碱，采用 RPHPLC 测定大鼠血浆中巴马汀与药根碱的浓度变化后，通过3P97 软件计算巴马汀与药根碱的药代动力学参数和口服生物利用度。大鼠经灌胃与尾静脉2种方式给予黄藤总生物碱 60 mg·kg-1后，测得的主要药代动力学参数如下：灌胃给药组中巴马汀和药根碱的Cmax分别为（091±006），（070±008） mg·L-1，tmax分别为（3524±083），（4776±124）min，t1/2分别为（18703±153），（10564±1699） min，AUC分别为（28030±1869），（14436±106） mg·min·L-1；静脉注射给药组中巴马汀和药根碱的t1/2分别为（17218±1238），（14726±182） min，AUC分别为（2 55314±21491），（32883±1081） mg·min·L-1。巴马汀的口服生物利用度为1098%，药根碱的口服生物利用度为4390%。

[关键词]黄藤总生物碱； 巴马汀； 药根碱； 药代动力学； 口服生物利用度； RPHPLC

[Abstract]In this study， the total alkaloids of Huangteng were given to the rats by the methods of intragastric administration and tail vein After the concentration changes of palmatine and jatrorrhizine in the plasma of rats were determined by RPHPLC， pharmacokinetic parameters and oral bioavailability were calculated by 3P97 software After the rats were pretreated with total alkaloid 60 mg·kg-1by the methods of intragastric administration and tail vein， the main pharmacokinetic parameters were determined as follows： in the intragastric administration group， the Cmax of palmatine and jatrorrhizine were （091±006）， （070±008） mg·L-1； tmax of palmatine and jatrorrhizine were （3524±083）， （4776±124） min； t1/2 of palmatine and jatrorrhizine were （18703±153）， （10564±1699） min， AUC of palmatine and jatrorrhizine were （28030±1869）， （14436±106） mg·min·L-1； in the intravenous injection group， the t1/2 of palmatine and jatrorrhizine were （17218±1238）， （14726±182） min； AUC of palmatine and jatrorrhizine were （2 55314±21491）， （32883±1081） mg·min·L-1 The oral bioavailability of palmatine was 1098% and jatrorrhizine was 4390%

[Key words]total alkaloids of Huangteng； palmatine； jatrorrhizine； pharmacokinetics； oral bioavailability； RPHPLC

黃藤为防己科植物黄藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤茎，味苦、性寒，始载于《本草纲目》，现收载于2015年版《中国药典》，具有清热解毒，泻火通便的功效[12]。黄藤的主要药效成分为黄藤总生物碱，主要为巴马汀（黄藤素）、药根碱、小檗碱等。这些生物碱成分化学结构相似，具有镇痛、镇静、抗菌、抗肿瘤、抗抑郁等药理作用[38]。迄今为止，测定黄藤总生物碱成分的方法主要有UV，HPLC，HPLCMS/MS，HPLCFLU等[914]。近年来对于生物碱的研究多以小檗碱为主，但对巴马汀和药根碱的研究却较少，且巴马汀生物利用度较低[8]，这在很大程度上限制了黄藤类制剂在临床应用。因此本实验以巴马汀和药根碱联合给药，建立灵敏度高，操作简便的HPLC对黄藤总生物碱在大鼠体内的药代动力学进行研究，并分别计算巴马汀和药根碱的口服生物利用度，旨在为黄藤总生物碱的进一步开发利用提供合理性依据。

1材料

11仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司）；5810R 台式高速离心机（美国贝克曼库尔特公司）；BSA224S 分析天平（德国赛多利斯公司）；HHS216水浴恒温振荡器（常州诺基仪器有限公司）。

12药品及试剂

黄藤总生物碱 （纯度≥96%，其中巴马汀含量为83%，药根碱含量为13%，实验室自制）；盐酸巴马汀对照品（纯度≥98%，上海源液生物有限公司，批号Z23O6L4910）；药根碱对照品（纯度≥98%，上海源液生物有限公司，批号Z06S653041）。甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯（美国 Fisher 公司）；实验用水为娃哈哈纯净水。

13动物

雄性Wistar大鼠，体重160～200 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物许可证号 SCXK（吉）20110004。

2方法

21色谱条件

ACE 5 C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；ZORBAX Eclipse XDCC18保护柱（46 mm×125 mm，5 μm）；流动相为乙腈04%磷酸（32∶68）；柱温40 ℃；体积流量10 mL·min-1；进样量10 μL；检测波长345 nm。

22对照品溶液的制备

精密称取盐酸巴马汀对照品 2 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得到 02 g·L-1盐酸巴马汀对照品溶液，置于4 ℃冰箱中备用。精密称取药根碱对照品1 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至10 mL，得到01 g·L-1药根碱对照品溶液，置于4 ℃冰箱中备用。

23黄藤总生物碱的制备

取50 g黄藤原药材，加入10倍体积的60%乙醇，加热回流2次，每次2 h，将提取液蒸干，得到干燥黄藤粉末。干燥黄藤粉末用D101大孔树脂进行纯化（40%乙醇等度洗脱），洗脱液蒸干，得到纯度为96%（巴马汀含量为80%以上）的黄藤总生物碱粉末，待用。

24给药与血药样品处理

将12只Wistar大鼠随机分成2组，每组6只。大鼠于实验前适应性喂养7 d，给药前12 h禁食不禁水。按 60 mg·kg-1等剂量灌胃给药和尾静脉注射给药，给药后于5，10，15，20，40，60，90，150，180，240，300，480 min尾静脉取血，至于肝素抗凝管中，以12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液100 μL，加300 μL甲醇，涡旋振荡10 s，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过045 μm滤膜，进样分析。

3结果

31专属性

取空白血浆、巴马汀对照品与药根碱对照品以及大鼠给药后血浆样品适量，按24项方法处理后，在21项色谱条件测定，见图1。

32线性关系

精密量取盐酸巴马汀与药根碱对照品，加入甲醇溶液，配置成一系列质量浓度的对照品溶液。取空白血浆05 mL，分别加入到1 mL各质量浓度系列的溶液中，配置成010，050，10，30，50，10，25 mg·L-1巴马汀血浆样品和 005，010，050，10，

20，50，10 mg·L-1药根碱血浆样品，按23项方法处理后，在21项色谱条件下进样测定相应峰面积。以血浆样品质量浓度为横坐标（X），样品峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得巴马汀回归方程 Y=4706 1X+1734 1（R2=0999 6），药根碱回归方程Y=3035 6X+0742 2（R2=0999 2），其结果表明巴马汀在010～25 mg·L-1，药根碱在005～10 mg·L-1线性关系良好，两者定量下限（LLOQ）分别为01，005 mg·L-1，最低检出量（LOD）分别为003，002 mg·L-1。

33精密度與准确度

精密吸取巴马汀与药根碱的对照品溶液，加入空白血浆制成低、中、高质量浓度为05，5，25 mg·L-1的巴马汀质控样品和低、中、高质量浓度为05，2，10 mg·L-1的药根碱质控样品，按24项方法处理。不同质控样品各5份，连续5 d测定血浆日内、日间精密度，见表1。

34稳定性

精密吸取盐酸巴马汀与药根碱的对照品溶液，加入空白血浆制成低、中、高质量浓度为05，5，25 mg·L-1的巴马汀质控样品与低、中、高质量浓度为05，2，10 mg·L-1的药根碱质控样品，按24项方法处理，不同质控样品各5份，分别置于室温24 h，反复冻融3次，-80 ℃下30 d，见表2。

35回收率

351相对回收率精密吸取巴马汀与药根碱的对照品溶液，分别加入空白血浆制成低、中、高质量浓度为05，5，25 mg·L-1的巴马汀质控样品和低、中、高质量浓度为05，2，10 mg·L-1的药根碱质控样品，按24项方法处理，不同质控样品6份，进样测得的实际浓度与质控浓度之比计算。结果3种质量浓度溶液的相对回收率见表3。

352绝对回收率精密吸取巴马汀与药根碱的对照品溶液，分别加入空白血浆制成低、中、高浓度为05，5，25 mg·L-1的巴马汀质控样品和低、中、高浓度为05，2，10 mg·L-1的药根碱质控样品，按24项方法处理，每种质量浓度 6 份，进样测得的峰面积与相应浓度的巴马汀与药根碱对照品溶液测得的峰面积之比的比值计算。结果3种质量浓度血浆样品的绝对回收率见表4。

36药动学参数和口服生物利用度

巴马汀与药根碱灌胃给药和尾静脉注射给药后，在大鼠血浆中血药浓度时间曲线见图 2。药动学参数数据采用3P97 软件进行处理和计算分析，见表5。根据口服生物利用度F=[（AUC口服× D静注） / （AUC静注× D口服）]×100 %，计算巴马汀和药根碱的口服生物利用度。

4讨论

黄藤作为我国传统中药，主要成分为异喹啉类生物碱（巴马汀、药根碱、小檗碱等）。因产地不同，黄藤中各生物碱的含量也有所不同。本文选用安徽省产黄藤，经提取纯化后黄藤总生物碱纯度可达96%，其中巴马汀的纯度高达80%以上，其次为药根碱，但并未检测到小檗碱。

近年研究表明，黄藤总生物碱具有镇痛、镇静、抗菌等药理活性，但因巴马汀作为黄藤总生物碱的主要药效成分，生物利用度极低，影响了黄藤总生物碱在临床上的应用。为了考察黄藤总生物碱在大鼠体内的药代动力学和生物利用度，本文以黄藤总生物碱中的巴马汀和药根碱为检测指标（因为未检测到小檗碱），通过不同色谱条件[1221]对比及改进后，确定以乙腈04%磷酸水（32∶68）为流动相，本研究选用的04%磷酸水的pH为174，因酸性较强，通过查阅文献[2，22]，在04%磷酸水中加入适量的十二烷基硫酸钠，调节pH后峰型和保留时间并无明显改善，因此最终确定以乙腈04%磷酸水（32∶68）为流动相，并且在该条件下巴马汀与药根碱的峰型最为良好。

本文中提到的黃藤总生物碱的给药计量是以巴马汀为指标，按体表面积法[23]换算大鼠的等效剂量，等效剂量的6倍为给药剂量，得出60 mg·kg-1，并且预实验表明静脉注射黄藤总生物碱60 mg·kg-1为安全剂量。

通过3P97 软件计算巴马汀与药根碱的药代动力学参数，并采用灌胃及尾静脉两种给药途径，对巴马汀和药根碱的生物利用度进行计算，结果表明巴马汀的口服生物利用为1098%，药根碱的口服生物利用度为4390%。此结果与之前单独巴马汀给药的生物利用度131%[8]相比有较大提高，说明黄藤生物碱之间的相互作用能够显著增加其原有的生物利用度。本实验还首次研究了药根碱的药动学，为黄藤总生物碱的进一步开发利用提供了借鉴与参考。

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[责任编辑张燕]