一例病死鱼的温和气单胞菌分离鉴定及药敏试验

孔海明

摘 要：草鱼是我国渔业的主要养殖品种之一，属于鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属的一种，又称白鲩，草根鱼，厚鱼。在生产实践中，草鱼的细菌性疾病时有发生，严重制约了草鱼产量的大幅度提高和品质的提升。因此，本文对一例气单胞菌引起池塘草鱼死亡案例进行分析。

关键词：草鱼；养殖；细菌疾病；药敏试验

随着人们对草食性鱼类的需求越来越大，草鱼的养殖也愈来愈热。草鱼性活泼，游泳迅速，常成群觅食。为典型的草食性鱼类。在干流或湖泊的深水处越冬。生殖季节亲鱼有溯游习性。但是草鱼疾病多，细菌性病原致病的情况很严重，且难控制，易造成大量死亡。因此，为提高草鱼养殖率，应加强对草鱼细菌性疾病的病原菌分离与鉴定来防治草鱼病害。

一、材料和方法

1.发病草鱼

2016年3月份，某草鱼养殖池塘出现草鱼死亡现象，池塘面积8×667m2，3台叶轮式增氧机，水深1.8m，池内有7500kg鱼，养殖前没有清塘，从3月中期开始，每天死亡十几条，观察发病草鱼，鱼体表发红，尾鳍发白，鳃盖、鳍条充血，剪开肚子有腹水，肝脏发黑，肠空、发红。

2.实验材料

LB固体培养基、70%酒精、冰箱、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、显微镜、培养皿、烧杯、研钵、试管、接种环、酒精灯等。

3.病原菌的分离与纯化培养

在无菌条件下，先用70%酒精对鱼体表面消毒，然后分别取草鱼的肝脏、肾脏、脾脏于无菌研钵中捣碎。分别加少量无菌水后分别划线接种于LB固体培养基平板上，放入28℃恒温培养箱中培养24h。选取平板上的优势菌落进行纯化培养，最终培养至3～5代后获得形态一致的纯菌落。选取单个菌落经过涂片、HE染色、镜检，确认为纯培养物。选取一个优势菌落，在LB固体培养基斜面上-80℃冰箱保存（通過抑制酶的活性来抑制细胞的生命活动的方式延长细胞存活时间），备用。

4.分离菌落观察

将纯培养物接种于LB固体培养基平板上，在28℃恒温培养箱中培养24h，观察并记录培养出的细菌菌落特征。将获得的纯培养物进行革兰染色。在载玻片上加1滴无菌水，用接种环挑取少许菌落与无菌水混合并进行均匀涂布。经自然干燥、火焰固定后，用草酸铵结晶紫染液染色1～2min，加水冲洗，再加革兰碘液后1～2min，加水冲洗，再加复红酒精染液等50～60s后加水冲洗。等待干燥后镜检。菌体被染成紫蓝色为阳性，被染成红色则为阴性。

5.病原菌的鉴定

采用API细菌数值鉴定系统，这同时能测定20项以上生化指标，可用做快速鉴定细菌的长形卡片（21cm×4.5cm，法国生产），上面排列着20个塑料管，管内加有适量糖类等生化反应的干粉（有标签标明）以及反应产物的显色剂。每份产品都有薄膜覆盖，这样保证了无杂菌污染。

使用时，首先打开内部附有的一瓶无菌基本培养基（液体），用来稀释待鉴定的纯菌落。把配制成的浓度适中的细菌悬液用无菌滴管逐个以0.1mL的量加入到每个小管中。在经过24～28h保温后，观看每个小管是否发生了显色反应。将结果记录在相应表格中，然后按照规定对结果进行编码、查检索表，就可以获得该菌种的鉴定结果。

6.药敏实验

药敏实验采用的是纸片法（购自杭州某微生物试剂公司），选用在生产上常用的药物进行实验研究。

首先进行细菌培养，用无菌生理盐水洗后吸取0.2mL菌液在LB固体培养基平板上进行均匀涂布。贴上药敏纸片，设4个平行实验组。放置于28℃的恒温培养箱中培养24h。观察有无抑菌圈产生，同时记录抑菌圈直径，计算其平均值。然后再重复做1次实验，最后依据抑菌圈直径比值照判断标准得到药敏实验结果。

7.临床用药

根据药敏实验结果和池塘情况使用药物治疗。

二、结果

1.病原菌分离与纯化培养结果

在LB固体培养基上形成菌落为其菌落形态：圆形、圆滑、湿润边缘整齐、微凸、半透明、灰白色至淡黄色中等大小的菌落，易挑取。

2.分离菌菌镜检结果

革兰染色阴性，短杆菌，悬滴标本观察动力，运动活泼（见图1）。

3.分离菌生理生化实验结果

结果见表1。

4.药敏实验结果

分离菌药敏实验结果见表2。

5.临床治疗结果

用药：第1天，阴雨天，死亡15条左右，上午10：00，“鳃皮肠利康”（1包）拌两包料。第2天，阴雨天，死亡6条，17：00，“鳃皮肠利康”（1包）拌1包料。第3天，阴天，死亡6、7条，10：00喂“鳃皮肠利康”（1包）拌2包料。之后，草鱼死亡量明显减少，病情基本得到控制。

三、讨论

根据分离菌的形态特征、培养特性和生化特性等实验结果确定该分离病原菌为气单胞菌。气单胞菌广泛分布于自然界中，能从表层和地下来源的饮用水中分离出该菌，气单胞菌属已经被国际上列为肠道致病菌之一，是危害草鱼的主要病原菌之一，感染后可发生胃肠炎、外伤感染和败血症并具有高病死率。实验从草鱼的肝脾肾等组织中分离出了气单胞菌，为临床治疗提供了理论依据。但由于时间等多种条件限制，不能做回归实验。

由药敏实验结果可知病原菌对“鳃皮肠利康”、“鳃肤康”、“出败康”、“氟多力”高度敏感。临床上选用高敏药物“鳃皮肠利康”（主要成分：诺氟沙星）进行的治疗，根据“鳃皮肠利康”特性采用了拌料口服的方式。诺氟沙星（Norfloxacin）化学名为1-乙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉羧酸，作用原理：通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡，是氟喹诺酮类抗菌药，对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高。盐酸小柴碱是小檗碱（Berberine）的盐酸盐（俗称盐酸黄连素），小檗碱分子式[C20H18NO4]+，是一种异喹啉生物碱，又称黄连素，存在于小檗科等4科10属的许多植物中，抗菌谱广，体外对多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用，临床主要用于肠道感染及菌痢等。

具体治疗：因前期没有清塘，草鱼出现死亡后用了絮凝的净水产品，使塘底滋生了更多的有害细菌。后来又用了很多杀虫的药物，破坏了水体的生态平衡，加上一直阴雨天气，池塘自净能力差，溶氧一直不高，建议首先控制好死亡量，然后改善好池塘环境，最后再根治鱼病。在注意增氧的前提下连续3d每天1包“鳃皮肠利康”拌料投喂，草鱼食欲恢复，死亡数量明显减少。

气单胞菌致病是由多种致病因子协同作用的结果，指导临床用药时为防止滥用抗生素而引起的病原菌抗药性问题，对分离的病原菌用药敏实验测定后再合理选用药物治疗才能达到最好的效果。该菌以往被认为是低毒力条件性病原菌，但近年该菌引起感染性疾病的报道日益增多，并对多种抗生素产生不同程度的耐药性，需要加以重视，注意卫生等各方面管理。临床上，早发现，早治疗，防止多种病原交叉感染，提高机体抵抗力，科学养殖。

四、结语

综上所述，养殖无公害草鱼的养殖基地应具备水源充足，水质良好，进排水畅通，鱼塘之间互不相通，交通运鱼方便，饲料资源丰富，生态环境条件良好。由于草鱼最容易生病，发病后造成草鱼大量死亡，给养殖生产带来很大危害，因此，一旦发现病死鱼，及时清理，以免扩大感染。控制合理的养殖密度，定期消毒，以防止其他有害病原滋生，造成混合感染，使病情加重。

参考文献：

[1] 巴翠玉，张雅斌，张培军，张蕾，冷东泽，李月红.大麻哈鱼温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国兽医科学.2016（06）.

[2]王海娟，王利.温和气单胞菌毒力基因的检测及其对鲫鱼致病性试验[J].动物医学进展. 2015（03）.