“PCR技术原理和应用”考点的复习建议

王锐利

1 理解PCR技术的基本原理及过程，能够区分PCR技术与细胞内DNA复制的异同

PCR的循环过程分为三部分：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。图1为大肠杆菌细胞内DNA复制示意图，与PCR技术相比，二者所用引物在化学本质上的区别是什么？图中所示的子代DNA中最终不含碱基U，其原因是什么？

如图，大肠杆菌细胞内DNA复制过程具备了边解旋边复制的特点以及半保留复制的方式。而且其中一条子链是连续合成，而另一条子链是不连续合成的，于是就形成了冈崎片段。胞内RNA引物完成延伸后，被RNA酶水解所形成的缺口再通过DNA连接酶连接起来。PCR过程和胞内DNA复制的异同点见表1。

2 PCR过程中引物设计的相关问题

引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。引物设计的原则有：① 引物序列设计要依据扩增目标DNA两端的部分序列，长度通常为20～30bp，尽量降低引物与非扩增区的同源性；② 引物内部不能存在部分互补序列；③ 两个引物之间不能存在部分互补序列；④ 引物是从引物的5′向3′方向延伸的，所以引物的5′端可以修饰，但3′端不可以修饰，否则会阻碍向3′方向的延伸。根据这些原则，引物设计的问题可以从以下几个角度进行命题。

2.1 引物序列的合理性

【例1】 某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图2），请问原因分别是什么？

分析与参考答案：根据引物设计原则可知，第一组引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而不能与目的基因上下游的特定序列结合而失效。第二组引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。

2.2 引物个数的问题（注意和探针个数的问题加以区别）

【例2】 一个目的基因通过PCR技术扩增n次时，总共需要多少个引物。扩增第n次时，又需要多少个引物。

分析这种题型可以借助于DNA的半保留复制模型，可知扩增n次，只有最初的DNA的两条模板链不需要引物，其他DNA链均需要引物，所以扩增n次，共需要引物（2n×2-2）个，即（2n-1）对引物。而探针个数的问题，又不能简单的类比引物个数的问题，如例3。

【例3】 TaqMan探针是qPCR技术中一种常用探针（图3），其5′末端连接荧光基团（R），3′末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在qPCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相應仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（图4）。

若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为a，加入的目的基因为b个，请根据图示过程，试用数学公式表示反应体系中荧光信号强度（Rn）与扩增次数（n）之间的关系是什么。

此问对能力的要求比较高，解答此题要明确两点：① 1个TaqMan探针只与DNA的一条链结合（注意有别于1对引物和DNA两条模板链结合），1个目的基因扩增1次，Rn=a，2个目的基因扩增1次，Rn=2a，4个目的基因扩增1次，Rn=4a。② 荧光强度会累积，即叠加下去。以1个目的基因扩增为例：扩增1次，Rn=a；扩增2次，Rn=a+2a；扩增3次，Rn=a+2a+4a；扩增4次，Rn=a+2a+4a+8a；如此扩增n次，Rn=a+2a+22a+23a+…+2n-a=（2n-1）a，所以加入目的基因为b个，Rn=ab×（2n-1）。所以，审题时要注意引物和探针与DNA结合的区别。

2.3 定点突变技术与引物设计

定点突变技术是指通过PCR技术向目的基因片段中引入所需变化。比如，GFP（绿色荧光蛋白）的发光基团是第65～67位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸），该发光基团可利用定点突变技术使第66位酪氨酸换成组氨酸，即可成为蓝色荧光蛋白（图5）。

定点突变第一步得把突变位点设计在引物上，如图5所示第66位酪氨酸（UAC）换成组氨酸（CAC），可以推导出相应的基因碱基序列由ATG突变为GTG。因此人工合成短DNA引物应包含的序列为AGAGTGCTC。由于突变位点的碱基不能够与模板链互不配对，所以突变位点一般设计在引物的中间位置，从而确保突变位点两侧的序列能够互不配对，同时还不妨碍3′的延伸，这样错配引物仍能引导完成DNA复制。最后，通过观察荧光蛋白是否发出蓝色光来检验该定点突变技术是否成功。

3 PCR结果的检测相关问题分析

3.1 PCR结果与遗传题

人类的甲型血友病为伴X隐性遗传疾病，致病基因用字母h表示；粘多糖病、葡萄糖-6磷酸脱氢酶缺乏症（俗称蚕豆黄）均为单基因遗传病，分别有A-a基因及E-e基因控制。图6为甲、乙家族通婚的遗传系谱图，通婚前，甲家族不具有粘多糖致病基因，乙家族不具有蚕豆黄致病基因，且Ⅰ-2不具蚕豆黄致病基因。

【例4】 根据条件可以推知图谱中，图谱中蚕豆黄病为伴X染色体隐形遗传病，粘多糖病为常染色体隐性遗传病。为了探明Ⅳ-2的病因，医院对上述遗传系谱图中的Ⅲ、Ⅳ代成员的该等位基因片段进行了PCR扩增，然后对扩增产物进行凝胶电泳，电泳的结果如图7所示。根据电泳结果与遗传系谱图，推论Ⅳ-2的无血友病XXY症的形成原因是什么。

根据原题目中已有的条件，可以判断电泳结果为2.45 kb是隐性基因，2.5 kb是显性基因，所以Ⅲ-3的基因型为XHXh。由于Ⅳ-2的细胞中无隐形基因，所以XXY症形成的原因是Ⅲ-3个体减数第二次分裂姐妹染色单体分离后没有分开进入两个子细胞中，而是进入了同一个卵细胞内，从而导致了XXY个体的出现。

3.2 PCR异常结果的分析

【例5】 电泳可以直观对比DNA的完整性，分子大小不同的DNA在凝胶上迁移速率不同，从而产生不同的条带。图8是上述实验中提取到的总DNA凝胶电泳结果，其中M是已知大小的不同DNA的混合物。实验结果显示A、B方法提取的总DNA电泳结果只有一条带，而C方法有明显的“拖尾”现象。① 只出现一条带的原因是什么？② 出现“拖尾”现象的原因是什么？

生物总DNA有多种DNA分子，只形成一条带说明完整DNA分子的分子量大，不易分离；若DNA分子发生断裂或降解，生成较多不同大小的相对较小的DNA分子，电泳时略有分离但又不充分，即出现“拖尾”现象。所以答案为：① 甜菜细胞基因组DNA分子都比较大，不容易分离；② DNA发生断裂或降解，形成许多大小不等的DNA片段。

4 小结

PCR技术是当今世界各国分子生物学研究的重要手段。其内容本身就很抽象，原理更是高中生目前认知水平所难以把握的。高考考纲将其纳为一个单独考点，旨在为高中生进入大学后能够快速向科研型人才转变做足铺垫，教师要引起重视。通过一轮复习，学生对PCR基本的生物学知识点均已重温了一遍，初步掌握了相关知识之间的关联，但由于学生的认知水平和能力有限，还不能准确地将零散但又有内在联系的知识点整合成块。

在此基础上，教师可以通过示意图形象深入地展示了PCR技术的原理和过程、通过罗列PCR引物方面的若干问题介绍了这一块考查的题型、通过对PCR结果的深入分析，让学生很好地掌握了PCR原理和PCR操作过程中的注意事项。这样，二轮复习的目标也就水到渠成了：① 要从全面基础复习转入重点复习，对各重点、难点进行提炼和训练；② 将一轮复习过的基础知识运用到实战考题中去，将已经掌握的知识转化为实际解题能力；③ 把握高考各题型的特点和规律，掌握解题方法，形成应试技巧。