神农架四种特色药用珍稀植物内生真菌的多样性研究

刘 乔 涂 璇,2 陈君芝 王洋洋 周金山 郭志勇,2 邓张双,2 包忻怡

(1. 三峡大学 生物与制药学院， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002)

神农架四种特色药用珍稀植物内生真菌的多样性研究

刘 乔1涂 璇1,2陈君芝1王洋洋1周金山1郭志勇1,2邓张双1,2包忻怡1

(1. 三峡大学 生物与制药学院， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002)

药用植物内生真菌是一类具有广泛的应用前景的微生物资源．本研究以神农架的特色药用植物红豆杉(TaxusChinensis)、珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)、白三七(Panaxnotoginseng)、七叶一枝花(Parispolyphylla.)为研究对象，利用rDNA-ITS序列对其健康组织的内生真菌多样性进行分析．结果表明，从这4种植物中共分离出97株归属于23个属具有丰富的生物多样性的内生真菌．其中从红豆杉中分离得到内生真菌70株，分属于21个属优势种属是镰刀菌属(Fusariumsp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)和拟茎点霉属(Phomopsissp.)；从白三七中分离内生真菌12株，归属于毛霉属(Mucorsp.)和镰刀菌属(Fusariumsp.)，从七叶一枝花中分离内生真菌6株，归属毛霉属(Mucorsp.)、镰刀菌属(Mucorsp.)和青霉属(Penicilliumsp.)，从珙桐中分离内生真菌9株炭角菌属(Xylariasp.)、炭团菌属(Hypoxylonsp.)、拟茎点霉属(Phomopsissp.)、链格孢属(Alternariasp.)、柄孢壳属(Podosporasp.)、间座壳属(Diaporthesp.)．

植物内生真菌； rDNA-ITS； 系统发育树； 多样性

植物内生真菌是一个多样性十分丰富的生物类群，普遍存在于各种陆生和水生植物中，其宿主涉及藻类、针叶树、灌木、草本等多个植物类群，其多数属于子囊菌亚门中的核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomycetes)和腔菌纲(Loculoascomycetes)及其无性态的多种真菌[1-2]．研究表明植物内生菌与宿主植物有着密切的关系，内生菌随宿主植物协同进化，参与植物的代谢和免疫，往往还能产生与宿主植物相同或结构类似的化合物，在天然药物开发和生态学研究中有着极为重要的作用[3-6]．

三峡地区的神农架原始森林拥有得天独厚的生态环境,使南北植物荟萃于此，森林资源丰富，为药用植物的孕育和繁衍提供了良好的生态条件．药用植物品种众多，门类齐全，蕴藏量极大，是举世闻名的“天然大药园”[7]．神农架地区分布着许多珍贵或面临濒危的药用植物，一方面人们希望开发利用药用植物中的有效成分，另一方面这些天然的药用珍惜濒危植物面临生存危机，解决这一矛盾的有效方式就是挖掘药用植物内生菌资源，寻找具有与宿主相同的活性化合物．红豆杉、珙桐、白三七(又名竹节参)和七叶一枝花(又名重楼)是神农架保护区非常有代表性的药用和珍稀濒危植物．由于过去长期不合理砍伐利用，野生资源日趋减少[8]，国内外关于红豆杉内生菌产紫杉醇类物质的研究十分火爆，但是关于珙桐、白三七和七叶一枝花内生菌的研究相对较少．

本文从神农架自然保护区采集这4种药用和珍稀植物的树皮、茎和叶，通过对其组织内内生真菌的多样性进行分析，为寻找开发宿主活性化合物的结构类似物提供科学依据．

1 材料与方法

1.1 植物样本的采集

实验所用植物材料于2012年5～11月间采自湖北神农架自然保护区．采集时一般选择生长在比较阴湿的植物多样性丰富的区域，且选择生长性状良好、无病虫害症状的的健康植株．草本植物采集全株，木本植物采集其不同部位的枝条、叶、树皮等．采集的样品装于密封塑料保鲜袋中做好标记并放入冰盒中．回到实验室后立即将植物样品放入4℃冷藏箱中低温保鲜，以确保样品内真菌的活性．采集回来的植物样品立即时进行内生真菌的分离．

1.2 内生真菌的分离纯化方法

剪取植物样品的根、茎和叶用清水洗净后，在75%乙醇中浸1 min，然后在3.25%的NaOCl中浸泡5 min，再次放入75%乙醇中浸30 s，最后用无菌水冲洗5次．样品用无菌吸水纸吸干后备用．将最后一次洗涤水吸取50 μL分别涂布在PDA平板上，置于28℃培养箱培养3 d，观察是否有菌落出现．将表面消毒后的样本接种到PDA双抗平板(灭菌的PDA倒平板前，加入青霉素钠溶液和硫酸链霉素溶液，使其终浓度分别为20 μg/mL，50 μg/mL)上，倒置于24℃培养箱培养15 d，待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分移至新鲜的PDA培养基上，纯化后接种于PDA斜面培养好后置于4℃冰箱中保藏备用．

1.3 内生真菌的ITS序列测定及系统发育分析

1.3.1 内生真菌的ITS序列测定

纯化后的菌种经马铃薯液体培养基培养24℃，150 r/min，7 d后过滤收集菌丝，取适量菌丝用液氮迅速研磨成粉末，然后采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒按操作说明进行提取，提取的DNA用灭菌的双蒸水洗脱，用于PCR扩增．用于ITS rDNA扩增的引物为一对通用引物．正向引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′．反应体系(50 μL)为：Sterilized H2O 22 μL，2×PCR Master 25 μL，DNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL；PCR反应条件：94℃ 5 min，然后94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，35个循环后72℃延伸10 min；采用DNA纯化回收试剂盒回收．测序由上海生工完成．

1.3.2 构建系统发育树分析

使用DNASTAR软件包中的SeqMan程序将测序得到的序列与相应的测序峰图进行人工校正，利用在线Blast工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)将测定的序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，选择同源性高的序列，对菌株进行初步的系统发育分析．利用 Mega5.0进行序列分析并且计算进化距离，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，1 000次Bootstrap．

2 结果分析

从三峡地区采集的红豆杉、白三七、七叶一枝花、珙桐4种植物样本，不同植物根据样本情况的不同采用根、茎、叶、果分离植物内生真菌，总共获得97株内生真菌．具体分别是分自红豆杉70株菌，白三七12株菌，七叶一枝花6株菌，珙桐9株菌(见表1)．

表1 种植物内生真菌的分离

2.1 内生真菌多样性分析

2.1.1 红豆杉内生真菌的多样性分析

从红豆杉的枝条中共分离出70株内生真菌，通过红豆杉内生真菌与31株参考真菌的ITS序列构建了NJ系统发育树，如图1所示红豆杉内生真菌具有丰富的多样性，从N-J树上可以看出，这70株内生菌处于5个大分支，归入21个不同种属，具体分类见表2．其中镰刀菌属(Fusariumsp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)和拟茎点霉属(Phomopsissp.)是优势菌属，占总分离株的15.7%、12.9%和10% ．此外还有木霉属(Trichodermasp.)，肉座菌属(Hypocreasp.)，间座壳属，粪生粪壳菌(Sordariasp.)炭角菌Xylariasp.黑孢霉(Nigrosporasp.)耙齿菌(Irpexsp.)橘青霉(Penicilliumsp.)球毛壳菌(Chaetomiumsp.)多节孢属(Nodulisporiumsp.)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeriasp.)光黑壳属(Preussiasp.) 火丝菌属(Pyronemasp.)深黄伞形霉(Umbelopsissp.)柄孢壳属(Podosporasp.) ，具体菌株号与鉴定结果见表2．

表2 红豆杉内生真菌的鉴定结果

图1 7红豆杉内生真菌基于ITS序列的N-J系统发育树

2.1.2 白三七和七叶一枝花内生真菌的多样性分析

白三七和七叶一枝花都是草本药用植物，由于野生的样品量较少，两个样品采集地在一起，本文就归在一起分析．从白三七的全草共分离到12株内生真菌，七叶一枝花是珍稀保护植物，只采集了少量的枝和叶片进行分离，共得到6株内生真菌．根据测定的rDNA-ITS序列与参比序列构建的NJ系统发育树来看，分离的菌株可能由于样本量较少，多样性并不丰富，具体结果如图2所示．这18株菌主要集中在毛霉属(Mucorsp.)，镰刀菌属(Fusariumsp.)和青霉属(Penicilliumsp.)，见表3．

图2 白三七和七叶一枝花内生真菌基于ITS序列的系统发育

宿主种属菌株数量所占比例/%菌株号白三七镰刀菌属Fusariumsp.650BS14、BS25、BS28、BS26、BS27、BS30毛霉属Mucorsp.650BS13、BS15、BS16、BS18、BS19、BS29镰刀菌属Fusariumsp.233.3B22、B23七叶一枝花毛霉属Mucorsp.233.3B11、B24青霉属Penicilliumsp.233.3B8、B10

2.1.3 珙桐内生真菌的多样性分析

珙桐属于国家一级保护珍稀濒危植物，野外分布极为稀少，样品获得也十分不易．本实验只采集了少量的珙桐枝条，共分离出9株内生真菌．虽然数量不多，但是也归属在6个不同的种属，优势菌属不明显，各菌属分布较为均匀，具体归属情况见表4．从在线比对的结果和N-J树上聚类的结果显示，GT-1，GT-3，GT-5和GT-9聚在一个分支，亲缘关系较近，但是在线比对后相近的菌属却不同．因此想要进一步确定其分类地位应该还要从其他几个看家基因的比对结果分析确定．

表4 珙桐内生真菌的鉴定结果

图3 珙桐内生真菌基于ITS序列的系统发育树

3 总结与讨论

植物内生菌作为重要的微生物资源，在药物先导化合物的开发中占有重要的地位，从红豆杉中分离的紫衫霉产生紫杉醇的结果后，大量的研究表明，在热带雨林植物和很多药用植物中都能发现多种活性的药物先导化合物[9-12]．此外在丰富微生物的生物多样性方面也成绩斐然，从内生菌中也发现了许多新种属的微生物[14-15]．在本研究中，分离获得的 70株红豆杉内生真菌分布在21个菌属，拟盘多毛孢属(Pestalotiopsissp.)、镰刀菌属(Fusariumsp.)和拟茎点霉属(Phomopsissp.)是优势菌群，具有丰富的种类多样性．从这些分离出的内生真菌蕴藏着多种生物活性，分离来自七叶一枝花的内生镰刀菌Fusariumsp.B23具有非常好的降解偶氮类染料苏丹红的能力(文章待发表)，而其中分离的一株青霉属的真菌能够产生含双环[4. 4. 1]环系甾体类结构物质，文献中此类化合物大多来自海洋生物．

本文在植物材料的选择上具有鲜明的地域特色，不仅有濒危的珍稀植物红豆杉和珙桐，也有珍贵的民间药用材料白三七和七叶一枝花．神农架原始森林的植物类群极为丰富，因而其蕴藏的内生真菌资源是一个巨大的微生物宝库，除了寻找药物活性先导化合物，植物内生真菌在生物降解和环境保护方面也值得大力开发．

[1] Sinclair J B, Cerkauskas. Latent Infection vs. Endophytic Colonization by Fungi[C]． In：Redlin S C, Carris L M eds. Endophytie Fungi in Grasses and Woody Plant：Systematics, Ecology, and Evolution. St. Pual, Minnesota：APS Press. 1996：3-29．

[2] Zheng R-y, Jiang H. An Endophytic Zygomycetes from Higher Plants[J]．Mycotaxon, Rhizomucor Endophyticus sp. Nov., 1995, 56：455-466．

[3] Strobelg G,Stierle A,Stierle D． Taxol and Taxane Production by Taxomyces Andreanae，an Endophytic Fungus of Pacific Yew[J]． Science,1993,260(5105):214-216．

[4] Hanausek T. Vorlaufige Mittheilung uber den von Lolium Temulentum Entdeckten Pilz[J]. Ber Dtsch Bot Ges，1898(16)：203．

[5] Palem P P C，Kuriakose G C，Jayabaskaran C．An Endophytic Fungus，Talaromyces Radicus, Isolated from Catharanthus Roseus， Produces Vincristine and Vinblastine，Which Induce Apoptotic Cell Death[J]．Plos One，2015, 10(2)：144476．

[6] Zhang L，Guo B，Li H，et al．Preliminary Study on the Isolation of Endophytic Fungus of Catharanthus Roseus and Its Fermentation to Produce Products of Therapeutic Value[J]．Chinese Traditional & Herbal drugs，2000，31(11)：805-807．

[7] 王俊峰,王仙.神农架药用植物资源及其开发利用.湖北林业科技, 1991(4):34-36．

[8] 汤景明. 神农架红豆杉分布及保护对策[J]．湖北林业科技, 1996(1)：31-33．

[9] Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and Taxane Production by Taxomyces Andreanae, an Endophytic Fungus of Pacific Yew [J]． Science, 1993, 260：214-216．

[10] Strobel G, Hess W M, Forde, et al. Taxol From Fungal Endophytes and the Lssue of Biodiversity[J]． Journal of Industrial Microbiology, 1996, 17：417-423．

[11] Li J Y, Sidhu R , Forde J, et al. The Induction of Production in the Endophytic Fungus——Periconiasp. from Torreya Grandifolia[J]． Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1998, 20：259-264．

[12] Strobel G, Forde, Li J R , et al. Seima Toantlerium Tepuiense Gen. nov. A Unique Epiphytic Fungus Producing Taxol from the Venezuelan-Guayana[J]． System Appl. Microbiol., 1996, 22：426-433．

[13] Bills G F，Polishook J. Recovery of Endophytic Fungi from Chamaecyparis Thyoides[J]． Sydowia，1992,44(1):12．

[14] Fisher P，Petrini O，Sutton B. A Comparative Study of Fungal Endophytes in Leaves， Xylem and Bark of Eucalyptus in Australia and England[J]. Sydowia，1993(45)：338-345．

[15] Hyde K，Frohlich J，Taylor J. Diversity of Ascomycetes on Palms in the Tropics[M]. Hong Kong University Press，Hong Kong，1997:141-156．

[责任编辑 周文凯]

Diversity of Endophytic Fungi in Four Endemic Medicinal Rare Plants of Shennongjia Nature Reserve

Liu Qiao1Tu Xuan1,2Chen Junzhi1Wang Yangyang1Zhou Jinshan1Guo Zhiyong1,2Deng Zhangshuang1,2Bao Xinyi1

(1. College of Biological & Pharmaceutical Science, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China； 2. Hubei Key Laboratory of Natural Product Research & Utilization, China Three Gorges Univ., Yichang 443002, China)

Endophytic fungi of medicinal plants are a kind of microbial resources with wide application prospect. In this study, four different special medicinal plantsTaxusChinensis,DavidiainvolucrataBaill.,Panaxnotoginseng, andParispolyphylla. of Shennongjia are discussed. The endophytic fungi diversity from healthy tissues are analyzed by rDNA-ITS sequences. The results show that a total of 97 endophytic fungi belonging to 23 genera were isolated from these four different plants. 70 strains of endophytic fungi belonging to 21 genera rich in biodiversity were isolated fromTaxusChinensis, and the dominant species wereFusariumsp.,Pestalotiopsissp., andPhomopsissp.. 12 strains of endophytic fungi belonging toMucorsp. andFusariumsp. were isolated fromPanaxnotoginseng. 6 strains of endophytic fungi were isolated fromParispolyphylla.., belonging toMucorsp.,Mucorsp., andPenicilliumsp.. 9 genera of endophytic fungi isolated fromDavidiainvolucrataBaill. wereXylariasp.,Hypoxylonsp., Phomopsis sp., Alternaria sp., Podospora sp., Diaporthe sp..

endophytic fungi in plants； rDNA-ITS； phylogenetic tree； diversity

2016-11-29

国家自然科学基金面上项目(31570543)；湖北省教育厅重点项目(D20141201)；三峡大学开放基金(2016KBC10)

涂 璇(1974-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事微生资源开发与利用研究．E-mail：tuxuan7@126.com

10.13393/j.cnki.issn.1672-948X.2017.04.021

Q949.32

A

1672-948X(2017)04-0101-05