头孢霉素与卡那霉素对花生组培苗生根的影响

阮建+郭峰+李新国+史灵敏+田海莹+张会+万书波+彭振英

摘要：抗性筛选是农杆菌介导的花生遗传转化过程中不可或缺的步骤，但是抗生素的使用对花生组培苗的生长与生根有着显著影响。为了明确抗生素对花生组培苗生根的敏感质量浓度，本试验以花生栽培品种丰花1号组培苗为材料，在培养基中添加不同浓度的头孢霉素与卡那霉素，检测花生组培苗的生根率及植株生长状况并进行统计分析。结果表明：0～250 mg/L的头孢霉素对花生组培苗生根及植株生长基本无影响。卡那霉素对花生组培苗生根影响较为显著，0～10 mg/L卡那霉素对花生组培苗生根与生长基本无影响，10 mg/L卡那霉素条件下组培苗不长侧根，15 mg/L卡那霉素显著抑制根的伸长；切去不生根的组培苗底端后移入MS培养基又能重新生根，不切去底端的组培苗则不生根。经过75 mg/L卡那霉素筛选的抗性组培苗的生根率可达31%。本研究可为花生遗传转化后期根的诱导提供一定的理论支持。

关键词：头孢霉素；卡那霉素；花生；组培苗；生根率；遗传转化

中图分类号：S565.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0033-05

Abstract Resistance screening is an indispensable step in Agrobacterium mediated genetic transformation of peanut， but the use of antibiotics have significant influence on peanut seedling growth and rooting. In order to make clear the sensitive concentration of antibiotics on rooting of peanut seedlings， the peanut cultivation variety Fenghua 1 tissue culture seedlings were used as experimental materials， and the culture media with different concentrations of kanamycin or cefotaxime were used to detect the peanut seedling rooting rate and growth status. The results showed that 0～250 mg/L cefotaxime had little effect on peanut growth，while kanamycin had significant effect on peanut seedling rooting. 0～10 mg/L kanamycin has no obvious effect on peanut seedling rooting and growth， but under the condition of 10 mg/L kanamycin， the seedlings had no branch roots， whats more， 15 mg/L kanamycin significantly inhibited the elongation of roots. When the rootless plantlets were transfered into MS medium after cutting off the bottom of the seedlings， the roots grew out again， whereas the rootless plantlets did not grow roots if not cutting off the bottom. After screening with 75 mg/L kanamycin， the rooting rate of the kanamycin-resistant tissue culture plantlets could reach 31%. This study could provide certain theoretical supports for roots induction during the late stage of peanut genetic transformation.

Keywords Cefotaxime； Kanamycin； Peanut； Tissue culture seedling； Rooting rate； Genetic transformation

花生（Arachis hypogaea L.）是世界主要油料作物之一，種植地区主要分布在亚洲、非洲和美洲。中国是花生生产和消费第一大国。花生油脂含量高达50%，与其它油料作物相比，在含油量、单产、单位面积产油量等方面均具有一定优势[1]。

基因工程为花生遗传改良提供了新的手段，可以通过外源基因导入及遗传调控技术提高花生的抗逆性和改良花生的营养品质[2-4]。花生常用的转化方法主要有三类：一是基因枪法转化胚性愈伤组织，通过体胚发生途径分化再生；二是农杆菌介导转化胚小叶、子叶（节）或胚轴外植体，通过体胚发生或器官发生途径分化再生；三是农杆菌介导转化茎尖外植体，直接发育成苗[5，6]。其中农杆菌介导转化法以其方法简单、效率高、拷贝数少等优点成为重要的、行之有效的方法之一[6]。

在花生阳性遗传转化植株筛选阶段，污染是经常发生的一种现象。污染包括真菌污染与细菌污染。真菌污染主要是孢子生长，污染后不易抑制应及时淘汰；细菌污染菌落吸附在培养基表面，可以通过抗生素进行抑制[7]。植物材料受农杆菌浸染后，经过一段时间的共培养，需要用抗生素及时有效地杀死或抑制细菌，以防止细菌危害植物组织并影响植株再生。常用抗生素为头孢霉素与青霉素[8，9]，后期还会利用卡那霉素等抗生素进行阳性苗筛选，但是向培养基中加入抗生素势必影响植物组织的正常生长与分化[10，11]。因此，研究抗生素对花生组培苗生根以及植株生长的影响，确定抗生素的适用范围和使用量，对优化花生遗传转化过程、提高遗传转化效率具有重要意义[12]。该试验旨在研究不同浓度头孢霉素和卡那霉素对花生组培苗生根及植株生长的影响，以期为提高花生组培苗的生根率提供有力依据。endprint

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生栽培品种丰花1号，本实验室自存。头孢霉素和卡那霉素均购自国药。试验于2016年在山东省农业科学院生物技术研究中心组培室进行。

1.2 花生组培苗培养

挑选饱满且大小均匀一致的丰花1号种子，用75%酒精溶液消毒2 min后用无菌水清洗两遍，再用0.1%升汞溶液消毒8 min后用无菌水反复清洗5～6遍。将种子剥皮后放入1/2 MS培养基，置于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养7天左右，切下顶芽作为外植体备用。

1.3 不同浓度抗生素处理

将切下的顶芽置于下列添加不同抗生素的MS基本培养基上。头孢霉素共计7个浓度梯度，分别为25、50、75、100、150、200、250 mg/L，以不添加头孢霉素的MS培养基为对照。卡那霉素共计6个浓度梯度，分别为5、10、15、20、25、30 mg/L，以不添加卡那霉素的MS培養基为对照。每种培养基插入的顶芽不少于30个。将培养材料置于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养，每日观察并记录植株生长与生根情况。

1.4 生根率与植株生长情况调查

从植株生根（0.1 cm）开始计算，到生根数目不再发生变化为止，计算每天的生根率，污染的植株不计算在内。生根率（%）=生根植株数/供试植株总数×100。

观察并分析不定根长度、粗细、生长状态、颜色变化及侧根萌发、植株生长情况等。

1.5 花生卡那抗性转基因组培苗的筛选与生根

花生遗传转化与阳性株系的筛选具体参照文献[13]进行。简述如下：将携带卡那抗性基因的载体PRI101-AN通过农杆菌介导的方法转化到花生品种丰花1号的下胚轴中，诱导下胚轴产生大量丛生芽；将丛生芽转移到含有75 mg/L卡那霉素的培养基上进行阳性组培苗的筛选，经过大约1个月的筛选获得抗性组培苗。将抗性组培苗切去茎底端，保留顶端较为幼嫩且木质化程度较低的部分，接种到不含卡那霉素的MS培养基上诱导不定根并进行生根率统计。

2 结果与分析

2.1 头孢霉素对花生组培苗生根和生长的影响

在植株培养第4天起组培苗基部不定根开始萌发，此时起统计其生根率（表1）。通过对试验组和对照组的比较分析，发现25～250 mg/L浓度的头孢霉素对花生植株生根基本无影响（最终发根率都在95%以上）。试验发现当不定根长到1 cm左右时开始长侧根，通过对各个浓度梯度的植株生长情况比较发现，不同头孢霉素浓度的培养基中组培苗生根的情况无明显差异，后期植株的株高及测根的生长情况都比较类似。这说明在25～250 mg/L浓度范围内，头孢霉素对花生组培苗生根及植株生长情况基本没有影响。

2.2 卡那霉素对花生组培苗生根与生长的影响

从植株培养第4天起统计其生根率，结果（表2）表明，不同浓度的卡那霉素显著影响花生组培苗生根和生长。5～15 mg/L浓度的卡那霉素对生根率的影响差异不显著，但经过后期不定根、植株生长的对比发现，卡那霉素浓度为5 mg/L时不定根比较粗短，侧根少；浓度为10 mg/L时不定根虽长但无侧根；浓度为15 mg/L时不定根均不到1 cm，以后便不再生长，呈现褐色。随着卡那霉素浓度的升高生根率越来越低，当浓度为20 mg/L时，不定根长只有0.1 cm；而当浓度提高到25 mg/L时，则能够完全抑制花生组培苗生根（表3、图1）。可见较高浓度的卡那霉素对花生组培苗生根具有显著的抑制作用。

就组培苗生长状况来说，5～10 mg/L卡那霉素处理与对照植株相比无明显差异，但15～20 mg/L卡那霉素处理的组培苗与对照相比则明显生长缓慢。第15天时，对各处理植株进行比较，25～30 mg/L卡那霉素处理下，植株一直保持原有高度（表3）。

将25～30 mg/L卡那霉素浓度处理下不生根的组培苗分成两部分，一部分直接转入MS培养基中继续培养，另一部分将茎底端切去以后转入MS培养基中继续培养。结果表明，切去茎底端的不生根组培苗又能重新生根且长势良好，没有切去底端的依然不能生根（图2）。

2.3 花生卡那抗性组培苗生根情况分析

上述试验结果表明，一定浓度的卡那霉素处理对花生组培苗生长具有显著的抑制作用。文献报道，高浓度的卡那霉素处理可使花生组培苗褪去绿色，植株变黄[14]，但是具有卡那抗性的转基因植株却能够一直保持绿色和良好的生长状态。这就是我们利用卡那霉素筛选抗性植株的依据。根据前期研究结果确定75 mg/L卡那霉素处理丰花1号转基因组培苗可以获得较为理想的筛选结果。为了验证这些转基因组培苗的生根情况，我们将其切去茎底端后接种到不含卡那霉素的MS培养基上诱导不定根。经过大约2～3周时间可见从茎底部长出不定根。据统计，生根率可达31%（图3）。

3 讨论与结论

花生是我国重要的经济作物。但是花生的组织培养与小麦、水稻、玉米等作物相比，差距很大，主要原因就是花生组培苗生根难、生根慢，而且生出的根多为畸形根，因而造成组培苗移栽成活率很低。对此人们想出很多办法来解决这个问题，其中较为有效的一种就是嫁接法[15，16]，暂时缓解了花生组培苗生根难的问题。但是嫁接苗毕竟不同于实生苗，外植体嫁接过程中砧木会对接穗的适应性、抗病性、开花结果能力产生影响[17-19]。尽管花生接穗与砧木都是同一品种，但新基因的导入很可能使砧木对接穗产生影响，这严重影响成活率及其后期的转基因苗的生理特性，因此要求花生的阳性转化株系必须长出自己的不定根。

抗生素（antibiotic）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，为能干扰其它生活细胞发育功能的化学物质。卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读。卡那霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。研究表明，卡那霉素对植物组培苗生长有明显的抑制作用，大多植物材料对卡那霉素的敏感浓度为 5～100 mg/L，但是不同植物、不同材料、不同培养阶段的耐受浓度各不相同。30 mg/L 卡那霉素能够明显抑制菊花茎段的分化，10 mg/L 能够抑制生根[20]。杨树叶片对卡那霉素的敏感浓度为 20～40 mg/L[21，22]。川芎的根、茎、叶对卡那霉素的耐受浓度为 20～40 mg/L[23]。黄瓜幼苗对卡那霉素的耐受浓度较高，可达200 mg/L[24]。endprint

在花生的遗传转化中，常以头孢霉素作为光谱抗菌剂抑制细菌的生长，避免植株遭受污染，而以卡那霉素作为筛选剂进行阳性株系的筛选。王凤欢等[14]研究花生胚小叶对卡那霉素的敏感性时发现，不同基因型对卡那霉素的敏感性不同，丛生芽生根的筛选浓度从10～20 mg/L不等。本研究表明，丰花1号组培苗对卡那霉素的敏感浓度为20 mg/L，高于此浓度则不生根。还发现，经过卡那霉素处理的不生根组培苗，须将其底端切去后再转入MS基本培养基中才能诱导产生不定根，而没有切去底端的组培苗则很难生根，这有可能是因为组培苗茎底端积累了较多卡那霉素，抑制了花生组培苗生根。

在花生的遗产转化中，卡那霉素的抗性筛选这个步骤至关重要。卡那霉素浓度太低，则不能充分抑制或杀死未转化的细胞，从而导致假阳性率过高；卡那霉素浓度过高，又抑制甚至杀死转化细胞，导致不能得到足量的转基因植株。因此需要对所选用的材料进行抗生素敏感性试验。然而，植物叶片对卡那霉素的耐受性高于根系[14]，经过高浓度卡那霉素筛选的抗性组培苗很难生根。本研究表明，经过75 mg/L卡那霉素筛选的花生组培苗其生根率仅有31%，如何进一步提高其生根率仍需进行深入探索。另外发现，切去抗性苗底端可以显著提高抗性组培苗生根率。本试验结果可以为花生建立抗性筛选体系、提高抗性转基因株系生根率提供技术支撑。

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