血浆MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平与肺动脉高压预后的相关性研究

张 岩， 王聪霞

(西安交通大学第二附属医院心血管内科， 陕西 西安 710004)

血浆MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平与肺动脉高压预后的相关性研究

张 岩， 王聪霞*

(西安交通大学第二附属医院心血管内科， 陕西 西安 710004)

目的：探讨患者血浆MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平与与肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)严重程度、预后的相关性。方法：采用微阵列法筛选112例PAH患者和100例健康对照者的血浆总RNA，采用实时定量聚合酶链反应测定miRNA-17-5p和miRNA-20a含量，测量PAH患者血浆中miRNA-17-5p、miRNA-20a的浓度。结果：在血浆miRNA浓度测定中，总共有58例miRNA血浆浓度在病例组和对照组中差异具有显著性。在PAH组中，miRNA-17-5p和miRNA-20a上调最为明显。ROC曲线分析显示血浆miRNA-17-5p、miRNA-20a的浓度与PAH患者两年生存率相关。Cox回归分析证实miRNA-17-5p和miRNA-20a水平是PAH生存率的重要预测因素。年龄、心脏指数、WHO分级、6min步行距离、疾病持续时间、红细胞分布宽度也可作为生存率的预测因子，加入这些协变量的多变量模型验证miRNA-17-5p和miRNA-20a水平是PAH两年生存率的独立预测因子。结论：血浆中miRNA-17-5p和miRNA-20a水平的增加与PAH患者的不良预后有关。

miRNA-17-5p； miRNA-20a； 肺动脉高压

我国的PAH的发病率和死亡率近年来迅速增加，已成为威胁我国公民健康的主要疾病。肺动脉高压是一种肺动脉内皮细胞(PAECs)和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)过度增殖导致的可致命的疾病。增生导致肺血管结构的变化，表现为PAECs和PASMCs的功能障碍，这是PAH的发病机制。增生进一步造成肺血管阻力增加，导致右心室心力衰竭[1]。miRNA是非蛋白编码RNA分子，参与多种必需基因的表达和细胞进化的过程，可调节转录或转录后表达。向下调节基因表达的miRNA结合3’末端非翻译区域的miRNA，有效的结合Watson-Crick配对算法，可以预测miRNA的靶基因[2]。miRNA可能在肺血管疾病通路中参与多种疾病的发生发展，在肺血管生长发育、疾病形成中起重要作用，肺血管稳态的破坏和此类miRNA下调参与PAH的发病机制[3]。骨形态蛋白Ⅱ型受体(BMPR2)、缺氧、STAT3和Apelin-APJ肺血管细胞信号通路与PAH的发生发展密切相关[4]。目前的研究表明，miRNA-17-5p和miRNA-20a与扩张型心肌病、先天性心脏病和中风相关。本研究的目的是探究血浆miRNA-17-5p和miRNA-20a与PAH严重程度、预后的相关性，进一步阐明miRNA是否可作为PAH病情程度及预后的独立预测因子及潜在生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取2010年1月至2013年12月患者进行PAH病例对照研究。病例组纳入112例PAH的患者，均符合PAH的诊断标准。PAH的诊断标准是根据最新指南制定出的[5]。同时选取100例健康者作为对照组。两组在性别、年龄上差异无显著性。与研究对象签署知情同意书，经过严格培训的调查员调查研究对象，采用统一的调查问卷，并随机进行质量控制。

1.2 方法:每个研究对象均空腹采集5mL外周血，1mL被送到实验室立即测定血液生化指标检测，包括血糖、总胆固醇、甘油三酯，用全自动生化分析仪(德国的欧罗巴XL-200)。其余4mL肝素抗凝并存储在-80℃的冰箱。在这项研究中，通过电话随访患者，总共106个PAH患者随访24个月。患者的生存状态在2015年12月20日被调查，死亡是主要终点。6名患者失访，主要是因为错误的电话号码、拒绝继续参与、搬出原来的地址或地址不清。失访患者基本人口学资料(年龄、性别、吸烟、饮酒)与研究组差异无统计学意义。伦理审查委员会批准了本项研究，并按照《赫尔辛基宣言》进行了研究。所有受试者均获得书面知情同意书。

1.3 microRNA检测:采用Tiangen试剂盒提取。先提取全血基因组DNA，从血浆、循环血细胞和肺组织中分离出总RNA。利用高通量实时荧光定量PCR检测系统，7900HT(96孔、384孔和Taqman低密度表达谱芯片兼容)，进行PCR反应和端板进行阅读和分析。miRNA的检测采用“geniom MEPA”芯片(FEBIT生物医学有限公司，海德堡，德国)。到目前为止，非管家基因的miRNA已被规范化验证。在样本中添加5nmoL/L秀丽隐杆线虫mir-39(cel-mir-39)，cel-mir-39是一个公认的对RNA制剂进行规范化测量的标志物。为最大限度检测miRNA的信息，采用微阵列检测受试者血浆样本的总RNA，通过实时定量PCR(qPCR)分别测量miRNA的含量。采用四分位数法、背景减法和消除极端离群值，进行数量统计。荧光定量PCR的方法检测与应用生物系统进行(卡尔斯巴德、CA)，microRNA检测应用Applied Biosystems仪检测(图1)。

图1 miRNA-17-5p和miRNA-20a测定曲线

1.4 统计分析:χ2检验和t检验进行两组间一般资料的分析。通过筛选分析，miRNA在病例组与对照组之间的最高倍的差异被认为是有研究价值的miRNA。采用多元Logistic回归分析计算其95% CI，OR值表示相对风险。随访时间为主要心血管事件发生日期、最后随访日期与诊断日期的差异。丢失的例数排除在审查数据外。ROC曲线评估全因死亡率下降和生物标志物两者之间的关系，以及生物标志物与预后之间的关系。Kaplan Meier进行生存分析，miRNA与患者死亡的发生率也进行相关分析。多变量Cox回归分析模型被用来计算风险比(HR)和95%可信区间。所有统计检验均为双概率检验，P<0.05被认为有统计学意义。所有数据均采用SPSS19.0软件包进行。

2 结 果

2.1 一般资料比较:从表1可以看出，病例组和对照组的年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。病例组与对照组收缩压、舒张压、体重指数差异无统计学意义(P>0.05)。病例组吸烟率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。两组饮酒量差异无统计学意义(P>0.05)。此外，病例组高血压史、糖尿病史及冠心病家族史均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。病例组高血压史明显高于对照组，但两组间收缩压和舒张压差异不显著，可能是由于长期服用抗高血压药物的关系。miRNA-17-5p和miRNA-20a在血浆分布中差异无显著性，血流动力学参数、治疗方法、N末端脑钠肽(NT-proBNP)、红细胞分布宽度(RDW)同为研究内容(表2)。miRNA-17-5p和miRNA-20a水平与6MWD、年龄和病程(表2，3)相关性较差。

2.2 miRNA-17-5p和miRNA-20a水平与PAH预后的相关性分析：从ROC曲线上看，miRNA-17-5p和miRNA-20a 水平与PAH患者2年生存率相关，与6mwd的距离也相关，是PAH生存率的独立预测因子(图2A)。患者miRNA-17-5p和miRNA-20a水平升高，6min步行距离缩短，且与生存时间缩短密切相关(图2C，D)。ROC分析也评估了最佳截断值，microrna-17-5p含量大于0.000689是预测2年生存率的重要指标(特异度76.5%，敏感度76.8%)，且在PAH的组中死亡率也较高(图2A)。miRNA-20a含量大于0.000732可用来预测PAH患者的2年生存率，特异度91.3%，灵敏度58.8%，可作为一个高危亚组(图2A)。

图2 miRNA-17-5p和miRNA-20a 水平与PAH预后的相关性分析

Cox回归生存分析确定miRNA-17-5p和miRNA-20a可PAH患者生存率的独立预测因子。年龄、EF值、WHO功能分级、6MWD、病程时间和RDW也可预测生存率(表4)。RDW及6MWD可独立预测PAH的生存率，增加了microrna-17-5p和miRNA-20a水平的多因素模型中，miRNA-17-5p 和miRNA-20a水平是PAH生存率的独立预测因素(危险比0.589，P = 0.012；危险比0.478，P<0.01)。在双变量模型中，研究的队列数据显示miRNA-17-5p和miRNA-20a是校正了年龄、EF值、疾病时间、NT-proBNP后的独立预测因子(表4)。

表1 一般资料比较

表2 miR17-5p水平在病例组中的分布情况

表3 miR20a水平在病例组中的分布情况

表4 Cox回归生存分析

3 讨 论

miRNA是一类高度保守的非编码小RNA的单链分子，长度约21至24个核苷酸。它与靶mRNA互补配对可以识别靶mRNA，通过降解mRNA或抑制其蛋白质的翻译而实现对靶基因的表达调控。因此，miRNA参与细胞的生长、发育、分化和增殖等生命过程。miRNA能够针对多个蛋白编码基因，参与多个细胞生长发育阶段的调控，在维护肺血管的平衡稳态中发挥重要的作用。miRNA表达的异常可能是各种疾病包括PAH的发病机制。

研究表明，miRNA-204在PAH患者的肺组织和PASMCs含量降低，并且在动物模型上发现miRNA-204与细胞增殖相关。miR-17/92簇也在PAH中表达，可通过IL-6信号通路下调(BMPR)-2下游区域[6]。miR-21可以通过BMP-Smad信号通路诱导，已报道其在PAH患者的血液细胞和肺组织样本下调[7]。miRNA与肺动脉高压的相关分析发现miRNA的变化及调节可能参与PAH的病理生理过程[8]。BMPR2信号通路在维持肺血管稳态[9]中起着至关重要的作用，这一信号通路受到干扰和BMPR2基因突变可能形成PAH[10]。虽然BMPR2功能障碍被认为是肺动脉高压的发病特征，很少有研究评估PAH与BMPR2功能障碍的相关机制。miRNAs是否参与BMPR2与PAH的发病过程尚未有相关研究。

有研究表明，miRNA-BMPR2信号通路的研究中，IL-6介导STAT3的激活诱导细胞miR-17-92基因簇的表达[11]。通过相应的miRNA基因簇编码miR-17-5p和miR-20a，可以针对性的下调BMPR2蛋白的表达[12]。因此，曾有两组研究评价这两个miRNA(miR-17和miR-20a)抑制剂治疗PAH的潜力。在啮齿类动物模型上，静脉注射miR-17抑制剂已被证明是改善实验性肺动脉高压(PAH)的手段。此外，用miR-17抑制剂[13]治疗后，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)，一个已知的miR-17目标基因，在小鼠和大鼠的肺组织中含量增加，在人肺动脉平滑肌细胞中也呈增加趋势[14]。同时也有研究表明，miR-20a抑制剂治疗对缺氧诱导的PAH模型小鼠右心室肥厚和肺动脉血管重构有改善作用，通过肺组织及肺动脉平滑肌细胞BMPR2的下游信号通路的诱导BMPR2的表达[15]。

本研究通过测定PAH的血浆miRNA的差异，提示miRNA-17-5p和miRNA-20a水平与PAH严重程度呈正相关。miRNA-17-5p和miRNA-20a水平升高，6min步行距离缩短，且与生存时间缩短密切相关。miRNA-17-5p含量大于0.000689是预测2年生存率的重要指标，且在PAH的组中死亡率也较高。miRNA-20a含量大于0.000732可用来预测PAH患者的2年生存率，可作为一个高危亚组。两者皆是6MWD、WHO功能分级和其他临床指标以外的独立预测因子。

本研究得出以下结论，miRNA-17-5p、miRNA-20a血浆水平PAH的生存率相关。miRNA-17-5p、miRNA-20a的重要性仍需进一步研究，其他miRNA与肺动脉高压的关系也需做进一步的相关研究。miRNA和PAH形成调节关系的研究为研究者揭示全新的视野，本研究为miRNA对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞离子通道影响提供依据，为PAH患者预后的预测提供独立的生物学指标。

[1] Chandra SM, Razavi H, Kim J,et al . Disruption of the Apelin-APJ system worsens hypoxia-induced pulmonary hypertension[J].Arterioscl Throm Vas, 2011, 31(5): 814～821.

[2] Kim J. Apelin-APJ Signaling: a potential therapeutic target for pulmonary arterial hypertension[J].Mol Cells, 2014,37(5): 196～201.

[3] Courboulin A, Paulin R, Giguere NJ, et al. Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension[J].Exp Med, 2011,211(9):535～548.

[4] Brock M, Trenkmann M, Gay RE, et al. Interleukin-6 modulates the expression of the bone morphogenic protein receptor type Ⅱ through a novel STAT3-microRNA cluster 17/92 pathway[J].Circ Res, 2009,104(10):1184～1191.

[5] Mclaughlin VV, Archer SL, Badesch DB, et al. ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension: a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association[J].Circulation, 2009,119(6):2250～2294.

[6] Davis BN, Hilyard AC, Lagna G, et al. SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation[J].Nature, 2008,454(6):56～61.

[7] Caruso P, Maclean MR, Khanin R, et al. Dynamic changes in lung microRNA process during the development of pulmonary hypertension due to chronic hypoxia and monocrotaline[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol ,2010,30(7):716～723.

[8] Parikh VN, Jin RC, Rabello S, et al. MicroRNA-21 integrates pathogenic signaling to control pulmonary hypertension: results of a network bioinformatics approach[J].Circulation, 2012, 125(8):1520～1532.

[9] Hogan BL. Bone morphogenetic proteins: multi-functional regulators of vertebrate development[J].Genes Dev, 2015,10(7): 1580～1594.

[10] Machado RD, Aldred M A, James V, et al . Mutations of the TGF-beta type Ⅱ receptor BMPR2 in pulmonary arterial hypertension[J].Hum Mutat, 2016, 27(8):121～132.

[11] Brock M, Trenkmann M, Gay R E,et al. Interleukin-6 modulates the expression of the bone morphogenic protein receptor type Ⅱ through a novel STAT3-microRNA cluster 17/92 pathway[J].Circ Res, 2015, 104(8):1184～1191.

[12] Pullamsetti SS, Doebele C, Fischer A, et al. Inhibition of microRNA-17 improves lung and heart function in experimental pulmonary hypertension[J].Am Respir Crit Care Med, 2013,185(7): 409～419.

[13] Brock M, Samillan VJ, Trenkmann M, et al. Antagomir directed against miR-20a restores functional BMPR2 signalling and prevents vascular remodelling in hypoxia-induced pulmonary hypertension[J].Eur Heart, 2012, 12(4):60～70.

[14] Zaidi SH, You XM, Ciura S, et al. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension[J].Circulation ,2002,105(9):516～521.

[15] Takahashi H, Goto N, Kojima Y, et al. Down regulation of type Ⅱ bone morphogenetic protein receptor in hypoxic pulmonary hypertension[J].Am Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006,290(8):450～458.

Correlation between Plasma Levels of MicroRNA-17-5p andmicroRNA-20 and Prognosis of Pulmonary Arterial Hypertension

ZHANGYan,WANGCongxia,LIYongqin,etal

(TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,ShaanxiXi'an710004,China)

Objective:To investigate the correlation between the level of plasma MicroRNA-17-5p and microRNA-20 and the severity and prognosis of pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods: A microarray screen was performed on total plasma RNA from 112 patients with PAH and 100 healthy control subjects Quantitative polymerase chain reaction commend increased microRNA-17-5p and microRNA-20a concentrations and was then used to measure microRNA-17-5p and microRNA-20a levels in cohort of patients with PAH's circulating microvesicles and blood cells. Results: Fifty-eight miRNAs showed differences in plasma concentration. MicroRNA-17-5p and microRNA-20a are the largest up-regulation in PAH. Receiver-operator-characteristic analysis showed both raw and normalized plasma microRNA-17-5p and microRNA-20a levels correlated with 2-year survival in patients with PAH. Cox regression analysis confirmed that miRNA-17-5p and miRNA-20a levels were important predictors of PAH survival. Age, baseline cardiac index, World Health Organization functional class, 6-minute walk distance, disease duration, and red cell distribution width also predicted survival. Entering these covariates in a multivariable model veried plasma microRNA-17-5p and microRNA-20a levels as independent predictoras of survival in PAH. Conclusion: Increased circulating microRNA-17-5p and microRNA-20a levels are associated with poor survival in PAH.

miRNA-17-5p; miRNA-20a; Pulmonary arterial hypertension

1006-6233(2017)08-1236-06

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.08.002

*【通讯作者】王聪霞， 李永勤， 张春艳， 胡艳超， 李满祥