正交试验法优化甲醇提取艾蒿中槲皮素工艺条件

沙芮++陈静++丁洁++牛犇++宋勇强++梁宁

摘要：以艾蒿为原料，槲皮素含量为指标，在单因素试验基础上，采用正交试验设计法优化甲醇提取艾蒿中槲皮素的工艺。结果表明，甲醇提取艾蒿中槲皮素最佳提取工藝为料液比1∶16（g/mL），甲醇体积分数100%，浸泡时间2 h，超声时间30 min。按优选工艺条件下槲皮素含量为0.698 mg/g，验证试验证明结果稳定，具有生产应用价值。

关键词：正交试验；艾蒿；槲皮素；甲醇

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）16-3133-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.034

Study on Orthogonal Test Optimization of Methanol Extraction of Quercetin from Artemisia argyi Process Conditions

SHA Rui，CHEN Jin，DING Jie，NIU Ben，SONG Yong-qiang，Liang Ning

（Commercial Technology Institute of Gansu Province，Lanzhou 730020， China）

Abstract： Artemisiaargyi was treated the raw material with methanolto extract quercetinand the yield of quercetinwas used to be an indicator. On the basis of single-factor experiments，the orthogonal experiment method were carried out to optimize the extraction process ofquercetin. The results showed that the optimal extraction parameters were found as follows：mass fraction of methanol 100%；material-to-liquid 1∶16 g/mL；soak time 4 h；ultraphonic time 30 min. According to the optimal process conditions the yield ofquercetin was 0.698%.It could be well fitted with model and was reliable and applicable for actual prediction.It had value of production.

Key words： the orthogonal experiment method； Artemisia argyi； quercetin； methanol

艾蒿（Artemisia argyi Levt. et Vant）为菊科（Compositae）艾属（Artemisia）多年生草本植物，主要分布于亚洲东部，如朝鲜半岛、日本、蒙古，中国东北、华北、华东、华南、西南、陕西及甘肃等地均有分布。其适应性强，普遍生长于路旁荒野、草地[1]。尤其以西北寒旱地区生长的有效成分高，品质优良药用价值高[2]。据文献报道[3-7]，艾蒿中的化学成分主要有黄酮、三萜、挥发油类，黄酮中含有槲皮素和柚皮素成分，槲皮素除有抗菌、消炎、抗癌、抗氧化、心血管系统保护作用外[8]，槲皮素联合放射线有显著减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原合成作用，槲皮素对皮肤具有保护作用。但目前对艾蒿中槲皮素定量的分析研究鲜见。槲皮素含量测定方法主要有高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法等。虽然高效液相色谱法检测限低、灵敏度高，但该方法检测设备成本高、耗时、操作步骤繁杂。而紫外分光光度法具有操作简便、成本低等特点。本研究采用紫外分光光度法艾蒿中槲皮素进行含量测定，为艾蒿黄酮类化合物定量分析提供一种简便、有效的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 艾叶产地河北，购自兰州黄河药材市场，经兰州大学药学院生药室马志刚教授鉴定；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号164782）；槲皮素标准品（ChromaDex，美国，批号00017030-566）；纯水（自制，pH 6.82，电导率15 μs/cm（27 ℃））。

1.1.2 仪器 UV2300Ⅱ型双光束紫外可见光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS225A型电子分析天平（普利塞斯公司，瑞士）；优普UPT-I-20L落地式纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 槲皮素标准品溶液制备[9] 精密称量槲皮素标准品5.13 mg，用5 mL甲醇溶液溶解，定容于5 mL容量瓶，得到浓度为1.026 0 mg/mL槲皮素标准品溶液。分别取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL定容于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液定容至10 mL，配置成标准溶液。在300～600 nm范围内扫描，槲皮素标准品溶液在370 nm处有最大吸收峰，和陈志刚等[10]测定的槲皮素最大吸收波长374 nm基本相同，以吸光度对质量浓度做标准曲线。槲皮素标准品在此质量浓度范围内与吸光度成良好线性关系。线性回归方程为y=7.617x-0.014，R2=0.991。槲皮素在0.015 5～0.094 4 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。endprint

1.2.2 槲皮素提取 称取5 g艾蒿，剪碎，放入250 mL三角瓶中，加入一定质量甲醇，浸泡，超声，过滤，计算艾蒿中槲皮素得率。

1.2.3 艾蒿提取槲皮素單因素试验[11] 固定艾蒿甲醇料液比（g/mL，下同）1∶12，甲醇体积分数80%、浸泡2 h、设定超声波功率100 W提取时间15 min的情况下，改变其中1个因素，料液比1∶12、1∶16、1∶20、 1∶24、1∶28；甲醇浓度60%、70%、80%、90%、100%；浸泡时间1、2、3、4、5、6 h；超声提取5、15、25、35、45 min，进行单因素试验，以得率为指标，择优参数。

1.2.4 正交试验设计 采用SPSS19.0软件，在单因素试验基础上，依据单因素试验结果设置水平，以料液比、甲醇体积分数、浸泡时间、超声时间4个因素的3个水平设计正交试验L9（34）优化艾蒿甲醇提取槲皮素工艺（表1）。

1.2.5 数据处理 采用SPSS19.0统计软件对试验数据进行分析，结果以平均值±标准误差（M±SE）表示，对各组结果采用统计学Duncan检验比较差异，以不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 料液比对槲皮素含量的影响 由图1可知，随着溶剂的增加槲皮素得率增加，差异显著。试验对比显示，料液比>1∶6时，甲醇刚刚浸没艾蒿，甲醇量过少对槲皮素的含量有影响。当料液比从1∶12降至1∶16，槲皮素得率大幅提高，说明甲醇量增加可以更好地析出槲皮素。当甲醇量继续增加，槲皮素得率变化不大，料液比低于1∶20后得率基本不变，说明溶剂量增大到一定程度，析出速率达到平衡。因此选择1∶12～1∶20为料液比的正交试验因素水平。

2.1.2 甲醇浓度对槲皮素得率的影响 由图2可知，随着甲醇体积分数提高槲皮素得率增加，差异显著。试验对比显示，甲醇体积分数﹤80%时，水中易浸出其他易溶于水的黄酮类物质，可能对槲皮素这种易溶于醇的极性较小苷元的浸出有影响。当甲醇体积分数>80%后，槲皮素得率基本不变，说明甲醇体积分数越大水的影响因素越小，溶解速率达到平衡。因此选择80%～100%为甲醇体积分数的正交试验因素水平。

2.1.3 浸泡时间对槲皮素得率影响 由图3可知，槲皮素得率随着浸泡时间的增加呈上升趋势，浸泡时间<3 h时，差异显著。浸泡超过3 h后提取率基本不变。由此可知通过浸泡有利于槲皮素浸出，但浸泡时间使槲皮素浸出能力有限，浸泡时间>3 h时，通过浸泡的溶解物质达到饱和，不再浸出。综合试验效率因素，选择时间2～6 h为浸泡时间的正交试验因素水平。

2.1.4 超声时间对槲皮素得率的影响 由图4可知，随着超声时间延长，槲皮素得率呈上升趋势，在15～35 min内槲皮素得率增加较快，且差异显著，超过35 min槲皮素得率基本不变，说明35 min左右槲皮素浸出达到平衡。随着超声时间加长，温度增高，槲皮素苷元浸出达到平衡，所以槲皮素得率基本不变。因此选择15～45 min为超声时间的正交试验因素水平。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，选择4个影响因素的3个水平设计正交实验L9（34）优化艾蒿槲皮素甲醇提取工艺（表1）。

由表2、表3可知，艾蒿槲皮素甲醇提取的影响因素中，甲醇体积分数影响极显著，料液比、超声时间影响不显著。由表2可知，最佳提取条件为A2B3C1D2；而极差分析结果中得出的最佳工艺方案是A2B3C2D3，二者不一致，通过验证试验比较，即料液比1∶16，甲醇体积分数100%，浸泡时间4 h，超声时间45 min条件下进行提取，计算槲皮素含量，重复6次，含量为0.665%，RSD=1.86%（n=6）。由此可知，在极差分析结果中得出的最佳提取条件和表2中得出的最佳提取条件提取率差异不大，综合成本因素，得出最佳提取条件为A2B3C1D2，即料液比1∶16，甲醇体积分数100%，浸泡时间2 h，超声时间30 min。

3 小结与讨论

1）槲皮素作为一种多羟基黄酮类化合物[12-18]具有多种生物学活性及很高的药用价值，槲皮素除了抗氧化清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒之外，近年来研究还发现槲皮素对心血管系统有保护作用，抗抑郁作用，而且槲皮素联合放射线显著减少体外培养瘢痕疙瘩治疗药物，与放疗联合作用，可减少放疗剂量，减轻放疗对正常皮肤的损害。而且槲皮素广泛存在于植物的花、果实中，目前已知有100多种中草药中含有槲皮素。而且艾蒿分布广泛，成活率高，成本低，可作为理想提取槲皮素植物。

2）槲皮素提取一般选用乙醇，甲醇或混合提取[19]，根据之前的提取研究，高体积分数的甲醇比乙醇对槲皮素的提取率高，所以本次试验选用甲醇作为提取溶剂。

3）超声提取利用超声波破坏植物细胞和细胞膜结构[20]，增加细胞内容物穿透力，有助于黄酮类化合物释放与溶出，同时超声波的热效应使得水温基本在57 ℃左右，对原料也有水浴作用。对比回流提取，具有省时、高效、节能、提高原料利用率的优点。

综上所述，通过单因素和正交试验，确定艾蒿中甲醇提取槲皮素最佳工艺参数为料液比1∶16，甲醇质量分数100%，浸泡时间2 h，超声时间30 min。槲皮素含量达0.698 mg/g。艾蒿分布广泛、成活率高、成本低，可作为理想提取槲皮素植物，为槲皮素的综合利用提供参考。

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