西方许旺酵母菌产双加氧酶的发酵条件研究

郑坚强+韩素娜+时锦锦+赵楠+彭新榜+司俊玲+许春平

摘要：将1株西方许旺酵母菌株应用于降解类β-胡萝卜素产生香味物质的体系中，为生物技术制备香精香料提供研究基础，对其液态发酵培养基及发酵条件进行优化，确定纯种液态发酵最佳培养基组分及发酵条件。以西方许旺酵母为试验菌株，采用摇瓶发酵的方式，研究培养基组分（碳源、氮源、无机盐离子）及添加量与发酵培养条件（温度、初始pH值、接种量、摇床转速）对菌种产双加氧酶的情况。结果表明，培养基最优组成为10.00 g/L葡萄糖、10.00 g/L 蛋白胨、5.00 g/L酵母粉、0.20 g/L FeSO4、0.45 g/L MgSO4·7H2O、3.00 g/L NaNO3、0.50 g/L KCl；最佳优化条件为温度27.90 ℃、起始pH值为7.21、转速为160.00 r/min、接种量为5.00%，发酵时间为72.00 h，此时酶活性达到1.23 U/mL，5次中心点重复试验结果稳定可靠；通过响应面分析发现，温度、起始pH值作用极显著，温度和起始pH值交互显著，客观反映了微生物的发酵条件。

关键词：西方许旺酵母；双加氧酶；发酵条件；优化

中图分类号： TS201.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0124-07

类胡萝卜素广泛分布于自然界中，是很多化合物的前体物质，如C13-类胡萝卜素（非萜类化合物），该化合物包括紫罗酮、二氢大马酮等，是构成茶叶、玫瑰、葡萄酒等的主要香味物质[1]。这些化合物香味阈值低，其中很多是强有效的香气化合物，已经引起香精香料行业的极大关注[2]。从植物资源中萃取类胡萝卜素降解的香味物质生产成本高，而采用生物技术制备的香味物质是纯度高的天然化合物[3]。有学者利用泥土中的细菌、丝状真菌降解类胡萝卜素转化为单环、双环的单萜，但实际应用很少，还没有任何一个单萜类的生物转化已经商品化、工业化生产[4-6]。

目前学术研究主要采用微生物固态发酵技术裂解（降解）类胡萝卜素，产生香味物质[7]。在广泛的筛选中，发现真菌、酵母菌具有降解类胡萝卜素的潜在能力。在以金银花为主要碳源化学成分的培养基中，有19种具有降解叶黄素的菌株（或者菌属）被分离出来，在这些分离得到的菌种中，有2种在发酵时可产生挥发性化合物[8]。Zorn等研究报道，50多种丝状真菌、酵母菌能有选择性地降解β-胡萝卜素转化为香味化合物，生物转化产物为单萜、倍半萜、三萜、四萜等化合物[9-10]。王树林等从沙棘汁中分离得到1株可降解β-胡萝卜素的菌株，并对培养基配方及培养条件进行优化[11]。麻俊侠等探索适于β-胡萝卜素降解葡萄球菌生长的最佳化学合成培养基配方，试验对培养基中的碳源、氮源、矿物质、各种生长因子等进行了研究，并确定了它们之间的配比，同时对发酵液的粗酶活进行了初步探索[12]。

查阅相关文献发现，国内外对微生物定向降解类胡萝卜素产生香味化合物进行了初步研究，没有进行工业化生物降解类胡萝卜素制备香味化合物生产的报道。此外，由于筛选的材料不同，导致筛选的菌株不同，菌株与培养基以及富含类胡萝卜素的原料不同，从而使菌种的发酵条件不同，导致降解类胡萝卜素生成的香味物质种类和含量有差异。

试验以笔者所在实验室筛选的西方许旺酵母菌为培养菌株，研究培养基、发酵条件对微生物产酶的影响情况，从而分析微生物菌体代谢能力及菌种的产酶效果。提高菌株产氧化酶（双加氧酶）能力，提高该微生物及其酶降解β-胡萝卜素生成香味成分的含量。试验目的在于提高该菌株产双加氧酶能力，为其后续在西方许旺酵母降解富含类胡萝卜素产品（番茄、枸杞等）生成香味物质的应用中提供研究基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试剂β-胡萝卜素（分析纯，美国Sigma公司）；β-紫罗兰酮（分析纯，美国Sigma公司）；葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸铵、硫酸亚铁、氯化钠、石油醚、吐温20、碳酸氢钠、乳糖、硼酸、麦芽糖、蔗糖，均为分析纯；酵母粉、琼脂粉、蛋白胨、天冬酰胺、麦芽提取物，均为生物试剂。

1.1.2仪器LDZX-75KBS立式蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SPX-160B-2培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；QYC-200摇床（上海福玛实验设备有限公司）；DGX-8053B干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；UV765紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；CF16RXI离心机（深圳市瑞鑫达科教仪器贸易部）；DK-S18水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；QL-866点动仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）等。

1.1.3培养基平板培养基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨 5.00 g/L，麦芽提取物3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，琼脂粉1500～20.00 g/L，β-胡萝卜素80.00 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。

种子培养基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，麦芽提取物 3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，K2HPO4 1.50 g/L，KCl 0.50 g/L，121 ℃，灭菌20 min。

液体发酵培养基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，麦芽提取物3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，MgSO4 0.50 g/L，NaNO3 3.00 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡萝卜素110.00 mg/L，121 ℃，灭菌20 min。

1.2试验方法

1.2.1菌体生长曲线的绘制西方许旺酵母菌种活化2代后，接种于150 mL种子培养基三角瓶中，28 ℃、160 r/min避光培养72 h后作为种子液。按5%（体积分数）接种量，接入装有150 mL发酵培养基的300 mL三角瓶中，于28 ℃、160 r/min 避光培養，每12 h取样1次，用分光光度计测量吸光度（D600 nm）。记录吸光度，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生长曲线。endprint

1.2.2摇瓶培养及菌种代谢产物的监测在300 mL锥形瓶中装入100 mL培养基，灭菌并冷却后，向锥形烧瓶中加入 1.0% 活化的菌液，在避光条件下28 ℃、150 r/min，培养24 h后，将16 mg β-胡萝卜素、10 g吐温20溶解在二氯甲烷中，溶剂在旋转蒸发器中蒸馏除去，抽滤除菌，然后加无菌水稀释至100 mL，平均加入到锥形瓶中，28 ℃、150 r/min，在避光条件下继续培养，并且每天对样品进行分析，剩余的β-胡萝卜素和代谢物从培养上清液中用二氯甲烷萃取3次，60 ℃水浴蒸发至1 mL，进行GC-MS分析。

1.2.3目标产物GC-MS分析条件色谱条件：毛细管柱：HP-5MS（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度 240 ℃；升温程序：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升温到 160 ℃，保持 2 min，再以8 ℃/min升温到260 ℃，保持 15 min；载气（He）恒流模式，流量1 mL/min；进样量2 μL，分流进样，分流比为25 ∶1。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度160 ℃；质量扫描范围35～455 m/z[13]。

1.2.4β-胡萝卜素储备液的制备避光称取5 mg β-胡萝卜素溶于10 mL二氯甲烷中，待β-胡萝卜素彻底溶解后加入1 g吐温20进行乳化。在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干净，倒入100 mL棕色容量瓶中定容，混合均匀，得到橘黄色清澈的β-胡萝卜素储备液备用。

1.2.5β-胡萝卜素标准曲线的制作分别取β-胡萝卜素储备液0、20、40、60、120、180、240、480 μL于棕色容量瓶中加蒸馏水定容至5 mL，以蒸馏水做空白对照，于450 nm处测定其吸光度，所得数据见图1，得到β-胡萝卜素溶液浓度与吸光度的线性关系。

β-胡萝卜素浓度与吸光度之间的线性方程：y=107.04x-0.432 6，决定系数r2=0.992。式中：y为β-胡萝卜素浓度（μmol/L）；x为吸光度。

1.2.6粗酶液的制备摇瓶发酵后得到发酵液，发酵液 4 ℃、10 000 r/min、离心20 min。上清液即为粗酶液。

1.2.7β-胡萝卜素的降解率及酶活性的计算取5 mL酶液（37 ℃水浴中保温）并加入500 μL β-胡萝卜素储备液，加入光程1 cm的玻璃比色皿中，以未加β-胡萝卜素储备液的粗酶液作对照，立刻在450 nm处测其吸光度，测完后立即在37 ℃下避光水浴，每隔1 min测定1次吸光度。酶活性单位定义：在37 ℃、pH值为6.5条件下1 min降解1 μmol β-胡萝卜素所需的酶量為1个单位。

β-胡萝卜素降解率及酶活性的计算公式：

降解率=原有β-胡萝卜素含量-现有β-胡萝卜素含量原有β-胡萝卜素含量；

酶活性=（C0-Ct）×（5.0+0.5）/5.0×t；

C0=初始β-胡萝卜素含量（μmol/L）；

Ct=t min后β-胡萝卜素含量（μmol/L）；

t=时间（min）。

1.2.8培养基优选试验

1.2.8.1培养基组分单因素试验（1）碳源筛选：分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉为发酵培养基中的唯一碳源，碳源浓度均为2%；氮源筛选：分别以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、（NH4）2SO4为发酵培养基中的唯一氮源，浓度均为10 g/L。葡萄糖添加量筛选：分别以5.00、10.00、1500、20.00、25.00、30.00 g/L 葡萄糖量进行发酵试验；酵母粉添加量筛选：分别以3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00 g/L酵母粉量进行发酵试验；蛋白胨筛选：分别以8.00、9.00、1000、11.00、12.00、13.00 g/L蛋白胨含量进行发酵试验。活化后的西方许旺酵母接入已灭菌的装有150 mL培养基的300 mL三角瓶中，接种量5%（体积分数），28 ℃培养72 h后，测定西方许旺酵母酶活性，试验数据为3次重复试验平均值。在此基础上，采用正交试验优化基础培养基组成。

（2）微量元素单因素试验：微量元素在西方许旺酵母生长繁殖和代谢过程中起着重要的作用，影响菌株产酶能力。测定西方许旺酵母酶活性，试验主要考察Fe2+、Mg2+、Na+ 、K+对菌株产双加氧酶的影响。FeSO4添加量筛选：分别以 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L FeSO4添加量进行发酵试验；MgSO4·7H2O添加量筛选：分别以0.40、0.45、0.50、055、0.60 g/L MgSO4·7H2O添加量进行发酵试验；NaNO3添加量筛选：分别以2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L NaNO3添加量进行发酵试验；KCl添加量筛选：分别以4.00、4.50、500、5.50、6.00 g/L NaNO3添加量进行发酵试验。通过测定西方许旺酵母酶活性，研究微量元素的添加量对西方许旺酵母菌株产酶的影响。在此基础上，采用正交试验优化微量元素组成。

配制液体发酵培养基前，用0.1 mol/L HCl将微量元素成分配制成使用浓度100倍贮液，即每100 mL 0.1 mol/L HCl溶解一定量的FeSO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、KCl，每配制 100 mL 液体发酵培养基取100倍贮液1 mL即可。

1.2.9发酵条件优化试验以优化的发酵培养基为基础。培养温度对菌株产酶的影响：以温度26.0、27.0、28.0、29.0、30.0 ℃等，于pH值7.0、160 r/min摇床培养72 h。培养基初始pH值对菌株产酶的影响：用0.1 mol/L HCl、NaOH溶液调节培养基初始pH值梯度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于 28 ℃、160 r/min摇床培养72 h。endprint