针刺大鼠“相对穴”阳陵泉与阴陵泉对P物质表达的影响研究❋

杨志新，刘丁丁，屈敬阳，安 娜，许 倩，陈 龙(. 承德医学院，河北 承德 067000； . 华北理工大学，河北 唐山 06000； . 河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院，河北 承德 067000)

【针灸研究】

针刺大鼠“相对穴”阳陵泉与阴陵泉对P物质表达的影响研究❋

杨志新1，刘丁丁2，屈敬阳3，安 娜3，许 倩1，陈 龙1
(1. 承德医学院，河北 承德 067000； 2. 华北理工大学，河北 唐山 063000； 3. 河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院，河北 承德 067000)

目的：观察针刺大鼠相对穴阴陵泉与阳陵泉后穴区局部和血清中P物质(SP)的表达，探讨SP变化与“相对穴”协同增效的相关性。方法：除空白对照组外，其他各组大鼠给予电针干预后采用酶联免疫技术检测实验前后大鼠血清中SP含量，穴区局部组织组化染色观察穴区SP阳性表达。结果：与对照组比较，其他各针刺组穴区局部SP阳性表达和血清中含量均有不同程度的增多，其中针刺相对穴阳陵泉与阴陵泉穴组SP表达最为显著，各针刺组比较，针刺旁开阳陵泉与阴陵泉穴组SP表达显著低于其他各组。结论：针刺相对穴阳陵泉与阴陵泉穴SP穴区局部阳性表达和血清含量显著增高，是相对穴配伍协同增效的可能因素之一。

相对穴；配穴；阳陵泉与阴陵泉；SP表达；针刺

P物质(substance P，SP)是一种广泛分布于神经系统和其他周围各组织器官的小分子神经非阿片肽，参与多种生命活动的调控，不仅参与免疫、生殖内分泌等调节，还在痛觉传递、胃肠蠕动、神经保护、呼吸运动、血管扩张、伤口愈合等方面起着举足轻重的作用[1-2]，同时也是针刺效应产生的关键启动因素之一[3]。相对穴[4-5]是指身体各部阴阳相对的2个腧穴，同时取用能发挥协同增效作用。阴阳互配，调节阴阳平衡，具有“从阴引阳，从阳引阴”之妙用[6]。前期研究表明，“相对穴”临床应用广泛，疗效肯定。本实验进行针刺“相对穴”阳陵泉与阴陵泉，观察电针刺激穴区后SP的局部部位表达及血清中的含量变化，初步探讨与“相对穴”协同增效的相关性，为更进一步深入研究提供一定的实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物

Wsitar大鼠40只，体质量230～240 g，雌雄不拘，北京维通利华实验动物技术有限公司提供(实验动物质量合格证号SCXK(京)2012-0001)。实验中对动物处置全过程完全遵照《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药品与试剂

小鼠源P物质一抗(美国Abcom公司，货号ab14184)，二步法免疫组化二抗试剂盒(北京中杉金桥公司，货号ZLI-9018)，ELISA试剂盒(上海酶连生物科技有限公司，货号ml003119)，华佗牌毫针(0.30 mm×40 mm，针柄20 mm，苏州医疗器械用品有限公司生产)。

1.3 仪器

DU800型紫外可见分光光度计(美国Ckman Coulter公司)、2K15型高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、显微镜(日本Nikon公司)、电针治疗仪G6805-Ⅱ型(青岛鑫升实业有限公司)

1.4 实验分组与处理

40只大鼠随机分成空白对照组(对照组)、针刺阳陵泉穴组(阳陵泉组)、针刺阴陵泉穴组(阴陵泉组)、针刺“相对穴”阳陵泉与阴陵泉穴组(阴-阳陵泉组)及针刺旁开阳陵泉与阴陵泉穴(旁阴-阳陵泉组)5组各8只。

对照组与其他各组以同样的方法和时间固定，不给予其他任何刺激；针刺选穴根据《实验针灸学》[7]大鼠常用针灸穴位，选取相对穴阳陵泉与阴陵泉穴，旁开对照点选各穴左侧旁开3 mm处[8]。采用电针法将大鼠固定，毫针针刺得气后针柄接电针治疗仪，刺激频率2/15 Hz，强度1 mA，20 min；在实验开始后的第1、3、5、7天进行实验干预共4次，每次干预结束后大鼠标准育成饲养过夜，最后1次干预完成后2 h取材。

1.5 指标检测

1.5.1 血清中SP含量 取各组大鼠腹主动脉血液并编号，分离血清采用酶联免疫技术，按照ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.5.2 穴区局部SP表达 采用组织化学技术检测：取新鲜穴区局部组织(包括皮肤、皮下组织和少量肌肉组织，约1 cm×1 cm×0.4 cm)石蜡包埋、切片，采用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蒸馏水洗2次，PBS洗2次，热修复抗原，然后浸入3%H2O2-甲醇，37 ℃温箱孵育30 min以灭活内源性酶。PBS洗3次后滴加正常山羊血清封闭液，37 ℃温箱孵育30 min,甩去多余液体、不洗。滴加1∶200稀释的一抗，4 ℃过夜，37 ℃温箱复温30 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗37℃30 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加辣根试剂，37℃30 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB避光显色，蒸馏水终止显色，苏木素轻度复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠穴区局部SP表达的变化

图1显示，较深色区域为SP阳性表达区域(箭头所示)。显微镜下观察其阳性表达程度为阴-阳陵泉组最为明显，阳陵泉组、阴陵泉组次之，对照组、旁阴-阳陵泉组表达最少。

图1 各组大鼠穴区局部SP阳性表达(×100,箭头所示)

2.2 各组大鼠血清中SP含量比较

表1显示，各组大鼠血清中SP含量依次为阴-阳陵泉组最多，阳陵泉组、阴陵泉组次之，对照组、旁阴-阳陵泉组最少。其中与对照组比较，其他各针刺组血清SP含量均有不同程度的增加。对照组与阳陵泉组、阴陵泉组、阴-阳陵泉组比较，各针刺组SP含量增多显著，差异有统计学意义(P<0.01)；对照组与旁阴-阳陵泉组比较，SP含量表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。阳陵泉与阴陵泉2组比较，血清SP水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清中SP的含量

注：与对照组比较:*P<0.05；与阳陵泉组比较:#P<0.05；与阴陵泉组比较:△P<0.05；与阴-阳陵泉组比较:※P<0.05

3 讨论

相对穴[6]作为一种新的配伍理论，阴阳或阴阳表里相配，在人体之根本即阴阳的调节方面起到“从阴引阳，从阳引阴”的作用。它是根据现代医学模式、疾病谱的变化和临床的需要，在传统腧穴配伍和阴阳理论的指导下，依据经脉循行规律、经脉与腧穴的密切关系，提出的一种取穴少、疗效好的配伍方式，其理论核心是“阴阳”。前期临床研究表明，“相对穴”配穴广泛，应用于内外妇儿各科疾病，特别是心血管、皮肤、五官、内分泌、神经等系统疾病，在临床上均有很好的治疗作用，往往能达到事半功倍、相得益彰的效果[9-11]。但其协同增效的作用机制尚不明确，本文系首次动物实验研究报道。

SP[12]是发现最早的神经肽类激素之一，是一种传递信息、调节机体反应的重要信使物质，可被免疫系统、神经系统和内分泌系统共同识别进而调节机体免疫和内分泌功能。它主要存在于神经纤维末梢部分，可以从初级神经纤维传入神经纤维的中枢端向脊髓背角释放，也可以从细纤维的外周端向皮肤释放，中枢端SP参与到感觉信息传递过程中，外周端SP参与到伤害性保护反应过程。前期研究表明，针刺时细神经纤维受到刺激后可使末梢神经中枢端和外周端同时释放P物质，发挥多种生理作用，产生针刺效应[13]。大量研究已证实[14-16]，针刺可通过影响肥大细胞(Mast cell，MC)功能状态，使MC聚集、脱颗粒释放活性物质，进而发挥针刺效应。也有实验表明[16-17]，针刺可作用于神经末梢，可以刺激局部神经末梢释放SP，SP可激活组织中MC脱颗粒释放生物活性介质发挥生物学效应，同时MC又可以释放SP作用于局部神经末梢，二者协同增强针刺效应。

本实验结果显示，针刺可使穴区局部SP阳性表达增多，血清含量升高，且针刺“相对穴”阴陵泉与阳陵泉穴组远高于其他各组。这一结果表明，SP的阳性表达是相对穴配伍协同增效的可能因素之一，同时提示我们可以将SP的阳性表达变化作为量化针效的参考指标之一，并为临床判断针效指标选取提供一定的实验依据和理论基础。但本实验也存在一些不足，只对穴区局部进行组织取材检测SP阳性表达，未涉及与其他部位之间的比较。本实验中穴区局部SP表达是采用形态学方法计量的，在图像采集和处理方面主观性强，可能影响实验结果的可靠性和可重复性，这些都需要我们进一步探讨和更深层次的研究。

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Effect of Acupuncture The Complementary Acupoints Yanglingquan and Yinlingquan on Substance P Expression

YANG Zhi-xin1, LIU Ding-ding2, QU Jing-yang3, AN Na3, XU Qian1, CHEN Long1
(1.ChengdeMedicalUniversity,HebeiChengde067000,China; 2.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,HebeiTangshan063000,China; 3.HebeiProvinceKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentforChineseMedicine,ChengdeMedicalUniversity,HebeiChengde067000,China)

Objective：To observe the expression of substance P in the point local and serum after acupuncture The Complementary Acupoints Yanglingquan and Yinlingquan in rats, so as to analyze the correlation with the change of substance P and the synergistic interaction of compatibility in Complementary Acupoints. Methods：40 SD rats were randomly and equally divided into 5 groups,8 rats each. Detecting the content of substance P in rats’ serum by ELISA technique and the expression of substance P in the point local by histochemistry method after electroacupuncture. Results：Compared with the group control, the positive expression of SP in the local area and the content of the serum in other groups were increased in different degrees. Compared with all of acupuncture groups, the SP expression was the least in the group of acupuncture the sideward of Yanglingquan and Yinlingquan. Conclusion：As compared with other groups, the positive expression of SP in the local area and the content of the serum were significantly increased.It is one of the possible factors for the synergistic interaction of compatibility in “Complementary Acupoints”.

Complementary Acupoints; Adjunct Points; Point Yanglingquan; Point Yinlingquan; SP expression; Acupuncture

河北省自然科学基金资助项目(H2014406047)-相对穴对MC趋经穴募集及细胞间通讯的作用机制研究；河北省高等学校科学技术研究重点项目(ZD20131001)-相对穴协同增效的细胞和分子作用机制研究

杨志新，女(满族)，河北人，教授，医学博士，博士研究生导师，从事相对穴临床与作用机制研究。

R245.81

B

1006-3250(2017)08-1132-03

2017-02-23