野茼蒿对溃疡性结肠炎模型大鼠血清中促炎和抗炎细胞因子的干预作用

冯陈慧　彭凡珂　寇力丹

[摘要]目的 探讨野茼蒿冻干粉对溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表达的影响。方法 选取健康雄性SD大鼠76只，先随机选出12只大鼠作为空白对照组，其余大鼠用TNBS/乙醇混合液诱导建立UC大鼠模型。造模成功后，所有大鼠每天用不同药物灌胃处理，观察大鼠的疾病活动指数（DAI）。第21天后下腔静脉取血，用ELISA法检测其血清中的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10含量。结果 与模型组和阳性对照组比较，野茼蒿各剂量组促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α含量不同程度降低（P<0.01或P<0.05），抗炎因子IL-10含量不同程度升高（P<0.01或P<0.05）。结论 野茼蒿冻干粉对UC大鼠的症状有一定的缓解作用，其机制或许与影响TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的表达有关。

[关键词]溃疡性结肠炎；野茼蒿；促炎细胞因子；抗炎细胞因子

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）08（a）-0004-03

[Abstract]Objective To investigate the influence of freeze dried powder of Crassocephalum crepidioides on the expression of serum cytokines TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10 in rats with ulcerative colitis （UC）.Methods 76 healthy male SD rats were randomly selected.Twelve rats were randomly selected as blank control group.The other rats were induced with TNBS/ethanol mixture to establish UC rat model.After successful model，all rats were treated with different drugs every day to observe the disease activity index （DAI）.The level of TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10 in the serum were measured by ELISA.Results Compared with model group and positive control group，the level of proinflammatory cytokines IL-6，IL-8 and TNF-α were decreased in varying degrees （P<0.01 or P<0.05），and the level of anti-inflammatory factor IL-10 were increased in varying degrees in different dose group of Crassocephalum crepidioides （P<0.01 or P<0.05）.Conclusion The freeze-dried powder of Crassocephalum crepidioides has a certain effect on the symptoms of UC rats.The mechanism may be related to influencing the expression of TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10.

[Key words]Ulcerative colitis；Crassocephalum crepidioides；Proinflammatory cytokines；Antiinflammatory cytokines

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的发病机制与免疫因素有关。近年来，中医药治疗UC的分子生物学和免疫学研究也取得了一定进展，白头翁汤、黄芩汤、四逆汤、乌梅丸和参苓白术散等中成药能改变UC大鼠血清或结肠组织中细胞因子含量[1]。研究表明，野茼蒿具有抑制肝癌和肺癌及皮肤癌症等功效， 调节机体免疫功能的作用[2]。现代临床医学试验证明，野茼蒿可治疗慢性肠胃病和习惯性便秘[3]，但是目前国内外关于野茼蒿的相关研究较少，亦无野茼蒿对UC大鼠血清中相关细胞因子的研究。本實验主要探讨野茼蒿对UC大鼠细胞因子的影响，为野茼蒿对UC的药用价值提供临床依据。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.1.1实验动物 76只雄性健康SD大鼠，体重（220±20）g，购于哈尔滨医科大学实验动物学中心，动物合格证号：SCXK（黑）2013001。

1.1.2药物与试剂 野茼蒿冻干粉：由小组成员于四川盆地采集，挑选光照充裕、长势良好的植株，采集后用清水洗净，自然风干。选取充分干燥的野茼蒿1 kg，用适量蒸馏水浸泡后，再加10倍体积的蒸馏水，煮沸2.5 h，重复3次，合并水煎液，用滤纸将溶液过滤，减压真空浓缩，冷冻干燥形成冻干粉，于-20℃冰箱中保存备用[4]，野茼蒿冻干粉内服成人用量为25～50 g/d，以50 g计算，按成人体重60 kg计算，成人用量大约为0.85 g/kg。大鼠低中高剂量按成人的2、4、8倍换算，则低中高三个剂量组的用量分别为1.7、3.4、6.8 g。所得样品分别溶于2 ml双蒸水中备用；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美国Sigma公司，批号：109K5008）的50%（体积分数）的乙醇溶液；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20130314）；96孔大鼠IL-6 ELISA试剂盒（产品编号：YY41731）、IL-8 ELISA试剂盒（产品编号：YY41716）、IL-10 ELISA试剂盒（产品编号：YY41736）、TNF-α ELISA（产品编号：YY41721）试剂盒：购于上海源叶生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶（SASP）肠溶片（上海中西三维药业有限公司，批号：31020450），成人用量2～3 g/d，（按3 g计算，以成人体重60 kg估算）成人用量约为0.05 g/kg。则大鼠用量为0.2 g/kg（按成人的4倍换算）将药物用蒸馏水配成200 ml的溶液[5]，4℃冰箱保存备用。endprint

1.2 试验方法

1.2.1 UC大鼠造模 先随机选取12只SD大鼠，正常饲养，不做处理，设定为空白对照组，余下的64只SD大鼠全部进行造模处理。先对这64只大鼠禁食不禁水处理24 h，然后用腹腔注射法将10%水合氯醛（0.25 ml/100 g）注入大鼠腹腔内对大鼠进行麻醉，腹腔注射时注意将大鼠头朝下，尾部倾斜向上，使体内脏器上移，避免注射器扎到内脏。麻醉成功后，将TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml）溶液缓慢推入大鼠肛门靠里一段距离，让动物保持下腹部上倾状态，捏紧肛门4 min，放回笼中，自然清醒[6]。

1.2.2 分组 造模后观察3 d，大鼠死亡2只，再随机挑选2只大鼠处死，将这4只大鼠进行解剖，取其结肠组织，确认模型构造成功。将剩下的UC大鼠随机分为5组：模型组，野茼蒿低剂量组，野茼蒿中剂量组，野茼蒿高剂量组，阳性对照组（SASP组），用苦味酸给各组大鼠进行编号。

1.2.3 给药方法 造模后第3天开始，阳性对照组给予SASP混悬液灌胃0.20 g/㎏；野茼蒿各剂量组分别给予0.85、1.70、3.40 g野茼蒿冻干粉溶液2 ml灌胃，空白对照组和模型组给予2 ml生理盐水灌胃，1次/d，连续21 d。

1.2.4 评分 持续观察大鼠体质量变化、大便性状、便血等情况。参照 Marines等[7]所列的标准进行评分，疾病活动指数（DAI）=（体重+大便形态+大便出血）/3。评分标准：无体质量下降、大便性状正常、无便血记为 0分； 体质量下降1%～5%记为1分；体质量下降5%～10%、半稀便、大便隐血（+）记2分；体质量下降10%～15%记为3分；体质量下降>15%、稀便、便血记为4分。

1.2.5 取材及测定 各组大鼠最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛溶液（0.3 ml/kg体重）麻醉大鼠，下腔静脉取血5 ml，离心后分离血清，用ELISA试剂检测血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10水平，检测方法参照说明书，记录结果。

1.3统计学分析

数据采用统计软件SPSS 17.0处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组DAI评分的比较

空白对照组DAI值一直保持较低，且波动不大，与空白对照组比较，模型组评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，各治疗组评分均明显降低（P<0.05或P<0.01）（表1）。

2.2各组细胞因子的比较

与空白对照组比较，模型组大鼠血清中IL-6，IL-8和TNF-α水平上升或显著上升（P<0.05或P<0.01），IL-10水平显著下降（P<0.01）；与模型组大鼠比较，野茼蒿中、高剂量组和SASP组大鼠血清IL-6，IL-8和TNF-α水平下降或显著下降（P<0.05或P<0.01），IL-10值上升或显著上升（P<0.05或P<0.01）（表2）。

3讨论

UC是一种结肠和直肠的慢性炎症性疾病，发病机制还不确切，结肠溃疡、黏液脓血便、腹泻等为其主要表现，该病病程长，且容易复发，难以治愈。大部分学者认为，UC的发病与环境、肠道微生物和遗传易感性共同作用相关，这些因素引起肠道免疫功能失常，形成结肠和直肠炎症性病变。慢性UC容易发展成结肠癌，因此受到国内外医学界的广泛关注[8]。

免疫系统（包括免疫细胞、免疫因子及免疫球蛋白）对肠道反应的调节有重要作用，UC的发病涉及T细胞亚群和炎症介质的变化[9]。近年来，研究表明，UC发生与发展的关键性因素就是免疫因素[10]，UC疾病进程中的一个重要环节包括不同细胞因子之间的网络作用[11]。其中，与UC病理过程密切相关的有TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子[12]和IL-4、IL-10等抗炎因子[13]，在UC的整个疾病进程中，促炎因子和抗炎因子的持续失衡起非常重要的作用[14-15]。

本实验结果显示，与空白对照组比较，造模各组不同程度出现精神萎靡、体重减轻、稀便、黏液血便等症状，且促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8水平较高，而IL-10这一抗炎因子水平较低，表明在UC大鼠血清中，促炎因子升高，且升高程度与炎症严重程度成正相关，抗炎因子降低，且降低程度与炎症严重程度成负相关。与模型组比较，各给药组大鼠这些症状持续时间较短，在给药过程中，疾病活动指数不同程度降低，且野茼蒿高剂量组的DAI评分比中低剂量组下降较明显，炎症程度也较轻；TNF-α、IL-6、IL-8水平下降，且剂量越高，下降越明显， IL-10水平上升，剂量越高，上升越多，与模型组比较有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。随着野茼蒿剂量的增加，UC大鼠的炎症状况逐渐得到改善，表明野茼蒿对UC的治疗是有作用的，其机制可能是通过降低血清中促炎细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，升高血清中抗炎细胞因子IL-10水平，来减轻UC大鼠的炎症反应，起保护肠黏膜的作用。

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（收稿日期：2017-05-05 本文编辑：许俊琴）endprint