内蒙古地区不同地理种群布氏田鼠遗传分化研究

魏文天　王玉民　何宏轩

摘要 [目的]探讨布氏田鼠地理种群的遗传分化。[方法]以MHCⅡ类基因第二外显子为分子标记进行序列分析和基因分型。结果：获得了内蒙古8个布氏田鼠地理种群460个样品的MHCⅡ类基因第二外显子基因的261 bp核苷酸序列，经单倍型分选后，共定义了21个单倍型，其中有3个单倍型为不同区域种群所共享，其余19个单倍型均为各区域种群所特有。单倍型网络进化关系分析显示，8个布氏田鼠地理种群形成3个稳定的进化支，分别与采集的地理种群相吻合：同一地理种群内单倍型之间遗传差异小，而不同地理来源的单倍型之间存在较大区别。AMOVA分析显示，遗传变异主要发生在区域类群间。对基因流和遗传分化系数、种群遗传距离和遗传相似度分析表明，布氏田鼠种群出现了一定的遗传分化，正镶白旗种群因浑善达克沙漠的阻碍而分化最明显。Mentel检测揭示布氏田鼠的遗传分化与地理距离无显著相关性。[结论]栖息地的复杂地形和气候变化可能是影响布氏田鼠群体间遗传分化的主要因素，而种群间距离隔离对于布氏田鼠的遗传分化作用不明显。

关键词 布氏田鼠；地理种群；MHCⅡ类基因；遗传分化；内蒙古

中图分类号 Q958.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）16-0220-04

Abstract [Objective]Explore the genetic differentiation of geographical populations of Lasiopodomys brandtii.[Methods]Sequences were analyzed based on MHC Class Ⅱ gene exon 2.[Results]261 bp nucleotide sequences of MHC ClassⅡexon 2 from 460 individuals of 8 L.brandtii populations were analyzed by the methods of polymerase chain reaction and direct sequencing. Result showed that 21 genotypes were detected from 460 individuals of 8 L.brandtii geo-populations in Inner Mongolia.Median-joining network grouped 21 haplotypes into three distinct clades，which corresponded to three geographic areas，indicating an obvious phylogeographic pattern. AMOVA showed that most of the genetic variation occurred among geographic groups.The analysis results of gene flow and F-Statistics，genetic similarity and genetic distance indicated that that genetic differentiation already occurred among geographic groups，Zhengxiangbaiqi population was separated geographically from all others，indicating that Hunshandake Sandy Land might make an effective barrier against gene flow.The result of Mantel test illustrated that there were no significant correlations between genetic distance and geographic distance.[Conclusions]Complex topographic configuration and climatic changes of habitat played the most important role and geographic distance was not significant in the genetic differentiation of L.brandtii populations.

Key words Lasiopodomys brandtii；geo-populations；MHC ClassⅡgene；genetic differentiation；Inner Mongolia

種群遗传学认为地理特征（地形障碍、空间距离等）或者历史事件（栖息地片段化、冰期隔离、种群扩张等）是限制基因流的重要因素，会影响种群遗传结构的形成过程，引起种群间的遗传分化[1-2]。

内蒙古自治区地形地貌复杂。在其中部地区、东部地区分布着毛乌素沙地、浑善达克沙地、乌珠穆沁沙地、科尔沁沙地、呼伦贝尔沙地，且气候多变，具有降水量少而不匀、寒暑变化剧烈的显著特点。本区分布的物种遗传结构受到了复杂的地质历史和地理特征的影响[3]。

布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）属啮齿目（Rodentia）仓鼠科（Cricetidae）田鼠亚科（Microtinae），为内蒙古草原代表性小型哺乳动物，是危害草原和鼠疫传播的宿主。种群成呈点状、片段化、间断性分布于内蒙古中部地区、东部地区，因其扩散能力弱，对栖息地环境有很强的依赖性，因而是研究复杂生境中环境压力对种群遗传影响的典型生物物种[4-6]。由于布氏田鼠长期受特定的地理环境条件胁迫和栖息地片段化的双重作用，有可能导致种群在分子水平上的差异而分化为不同的适应性种群，对草原的保护和疫病防治产生重要影响。Wang等[7]基于微卫星标记对内蒙古4个布氏田鼠地理种群遗传结构分析表明，受草原荒漠化的影响，种群内近交现象严重，基因流呈现海岛模式，正镶白旗种群与其他种群出现分化。endprint

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex， MHC）作为分子标记已被广泛应用于物种间的系统关系、进化历史和种群遗传结构的研究[8-10]。为得到布氏田鼠种群遗传分化的分子证据，为布氏田鼠的防治提供科学依据，本文基于MHCⅡ类基因探讨了内蒙古地区布氏田鼠不同地理种群的遗传相似性和遗传差异、遗传距离与地理距离之间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究区域和样本采集

样品采自8个种群，分别来源于锡林浩特（XL，44°50.351′N，115°13.673′E；n=68）、二连浩特（EL，43°53.245′N，112°23.564′E；n=65）、东乌珠穆沁旗（DW，44°59.454′N，116°10.846′E；n=54）、西乌珠穆沁旗（XW，44°5.211′N，117°57.324′E；n=53）、新巴尔虎左旗（XZ，49°18.152′N，118°03.776′E；n=56）、陈巴尔虎旗（CB，49°32.652′N，119°44.735′E；n=52）、新巴尔虎右旗（XY，48°21.625′N，118°22.573′E；n=50）、正镶白旗（ZX，42°25.611′N，115°16.331′E；n=62）地区，共460只布氏田鼠，各取样点间的距离不低于100 km。样品采集信息及种群分布见图1。

1.2 基因组DNA提取与PCR扩增

用DNA试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）提取基因组。从GenBank下载布氏田鼠亲缘种的MHCⅡ类基因第二外显子序列（AJ003232，AF084934，U88933，M73960，BC132163，K0012，AJ634270）作为参考序列，经 Blast 比对筛选出保守片段，通过软件Primer premier 5.0设计1对引物：5′-GGAA-TACGGTACATCTGAG-3′（上游引物MF）、5′-CAACTCTCC-GCCGCACAAGG-3′（下游引物MR），并由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应在PTC-200型DNA扩增仪上进行，PCR反应体系总体积为30 μL，其中含有1.0 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、1.5 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl、150 μmol/L dNTPs，引物各0.25 μmol，1U Taq DNA聚合酶，30 ng DNA。

反应程序为94 ℃变性45 s，54 ℃复性50 s，72 ℃延伸50 s，共进行30个循环。循环前95 ℃预变性5 min，循环后继续延伸10 min。用1.5%琼脂糖电泳检测PCR产物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行正反测序。

1.3 数据分析

用Chromas 软件对测序原始结果进行人工校对，用MEGA（version 5.0）软件进行序列比对分析；用Network 4.6.0.0软件[11]构建布氏田鼠种群的中介网络图（median-joining ne-twork）。

利用POPGENE version 1.32软件分析计算种群的遗传距离（GD）和遗传相似度（GI）；用Arlequin 3.5 version[12]软件计算区域种群间的基因流Nm（gene flow）和遗传分化系数Fst（F-Statistics），用该软件中的分子变异分析（analysis of mol-ecular variance， AMOVA）检测地理种群内和地理种群间的遗传分化。以种群为单位，用Arlequin 3.5 version软件的Mantel检验（permutation=3 000）分析种群间遗传距离（GD）和地理距离（GGD）的相关性。

2 结果与分析

2.1 MHCⅡ类基因第二外显子序列特征

本研究测定了8个地理种群的460只布氏田鼠的MHCⅡ类基因第二外显子序列，序列长261 bp。经单倍型分选后，在460个样品中共存在21种单倍型，分别命名为H01-21（图2）。以单倍型H01（Haplotype 01）为标准进行多态位点分析，有57个突变位点，包括10個单突变位点、47个简约信息位点，突变位点百分率为21.84%。

2.2 单倍型网络进化关系分析

单倍型网络进化关系分析结果显示，21个单倍型分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ三进化枝。其中，位于内蒙古东北部的陈巴尔虎等3个种群有10个单倍型，位于内蒙古中部的锡林浩特等4个种群10个单倍型，位于浑善达克沙漠南部的正镶白旗种群7个单倍型，8个地理种群有3个共享单倍型（图3）。3个进化枝分别与采集的地理种群相吻合。

2.3 布氏田鼠种群的遗传分化

作为影响种群遗传分化的重要因素——基因流，其流越弱，表明群体间的基因流水平较低，种群间遗传分化较大。按单倍型网络进化关系分析划分的3个区域类群之间的基因流（Nm）和遗传分化系数（Fst）值如表1所示。类群间的遗传分化指数FST值分析显示，区域类群GroupⅠ与GroupⅡ的Fst值为0.3646，区域类群GroupⅢ与其他区域类群的Fst值为0.823 2～0.834 7，布氏田鼠类群Fst P值均<0.05的检验水平。区域类群GroupⅠ与GroupⅡ的Nm为0.234 2，区域类群Group Ⅲ与其他区域类群的Nm为0.098 8～0.103 7，各种群间的基因交流均<1，尤其是类群Group Ⅲ与其他 2个种群之间的基因交流值最小。

以上分析揭示区域类群GroupⅠ与GroupⅡ间出现了分化的趋势，但遗传分化水平相对较低，而Group Ⅲ的正镶白旗种群与其他种群之间有较高的遗传分化。根据地理分布及系统分析结果，将3个地理种群和8个小种群进行遗传变异的分子变异等级分析（AMOVA），结果见表2。区域类群间的遗传变异占总变异比率的64.08%，区域内种群间的变异组分为7.78%，小群体内的变异组分为28.14%。区域内种群间小种群之间的遗传变异要小于区域类群间的遗传变异，布氏田鼠具有很高的遗传结构。遗传变异主要发生在区域之间和种群内，且P值显著。endprint

种群间的遗传距离（GD）、遗传相似度（GI）和地理距离（GGD）见表3。各种群间亲缘关系的远近可以通过Nei′s标准遗传距离（GD）和遗传相似度（GI）的大小反映，当GI≥0.6时，认为各种群间的基因交流非常频繁。遗传距离分析揭示，布氏田鼠种群之间的遗传距离最小值为0.092 1，最大值为0.246 7，其中正镶白旗种群与其他种群的遗传距离在0.197 9～0.246 7之间，遗传距离大，分化明显。遗传相似度分析显示，布氏田鼠种群之间的遗传相似度在0.507 4～0.921 1之间，除正镶白旗种群与其他种群遗传相似度均<0.6，其他种群之间的遗传相似度均>0.6。以上分析结果反映正镶白旗种群与其他种群间基因交流较低，与上述遗传分化的结果基本一致。

2.4 Mantel test分析

种群间的遗传距离（GD）与地理距离（GGD）见表3。在地理距离隔离的Mantel检验中，统计遗传距离和地理距离后，将遗传距离同地理距离之间做相关性检验，判断布氏田鼠地理种群间是否存在地理隔离因素。应用SPSS对8个种群遗传距离与各采样点间地理距离做回归分析，得到了地理距离与遗传距离的关系图（图4）。可以看出，数据点比较分散的分布于折线周围，没有明显的规律性。Mantel检验结果显示R2=0.315 9，P>0.05，表明种群间的遗传距离和地理距离无显著相关性。

3 结论与讨论

遗传结构是种群中遗传变异分布的时空格局，它受突变、基因流、自然选择和遗传漂变的影响，或者是取决于种群单位间的扩散规模[13-15]。种群遗传结构的改变和种群分化是研究微进化过程的核心内容[16-18]，也是物种形成过程中具有决定意义的一步。Wang等[7]对内蒙古3个布氏田鼠地理种群遗传结构分析显示，种群呈现较高水平的遗传分化，遗传分化与地理距离没有显著相关性，布氏田鼠有限的迁徙能力和栖息地破碎化是引起种群遗传分化的重要因素。

本研究采集来自内蒙古中部和东北部的8个布氏田鼠种群，构建的单倍型中介网络图直观的表明布氏田鼠种群21种单倍型分布于3个类群，分别与采集的地理种群相吻合：同一地理种群内单倍型之间遗传差异小，而不同区域种群间的单倍型之间存在较大区别。基于基因流、遗传分化系数等数据分析表明，正镶白旗种群与其他种群间的分化较显著，而GroupⅠ和GroupⅡ区域类群间已呈现分化趋势。导致种群分化可能有以下因素：首先，田鼠形成于8～7 MaBP以前，在第三纪（距今800万年至250万年前）田鼠栖息地呈广泛、连续分布[19]。第四纪（距今248万年前）青藏高原抬升及多次冰期、间冰期的影响，使原连续分布的田鼠呈现隔绝、间断、点、片状、不连续分布[19]。内蒙古高原为田鼠提供了冰期避难场所，而生物避难场所由于种群空间分离形成异域种群，为新种或新亚种形成提供条件[20]，这是引起种群遗传分化的地质因素。其次，布氏田鼠的迁徙在很大程度上受到内蒙古草原复杂多变的地形地貌的影响，削弱了种群间的基因交流。尤其是浑善达克沙地形成了布氏田鼠的迁徙地理屏障，逐渐把GroupⅢ与其他区域类群隔离开来，在长期进化过程中产生遗传分化，这是引起种群遗传分化的地理因素。再次，内蒙古自治区地形狭长，不同地理区划内的气候、地形、植被条件对布氏田鼠的分布和生存有重要影響。因此，栖息地片段化和复杂多变的地理气候形成的生境隔离在很大程度上影响了本来就很有限的布氏田鼠迁徙能力，从而削弱了种群间的基因交流，这是引起布氏田鼠种群遗传分化的生态因素。最后，布氏田鼠是一种营聚集生活的小型哺乳动物，虽然分布区域广、繁殖力强，但扩散能力相对较弱，因而可能较易受距离隔离的影响而限制了种群间基因交流，这是产生遗传分化的物种因素。距离隔离[21]理论认为，空间距离因素会限制基因流在种群间发生，导致种群产生遗传分化，并随着种群间地理距离的增加，其遗传差异性也不断增大。

古生物学和生态学证据表明，一些小型啮齿类动物会强烈地依赖特定的栖息地生境，环境的影响会改变其遗传模式[22]。黄 翔等[23]对蒙新区子午沙鼠种群遗传结构的研究表明，子午沙鼠种群遗传结构与地理距离没有显著的相关性，而影响种群遗传结构的关键因素是蒙新干的海拔。

本文研究的8个布氏田鼠种群之间的地理距离基本超过200 km，遗传距离与地理距离的回归分析和Mantel检验显示，布氏田鼠种群遗传分化与地理距离没有显著相关性，表明地理距离对该研究区域的布氏田鼠种群分化格局影响微小，即使在地理上相距较远的种群间也没有显著的遗传差异，说明种群间隔距离对于布氏田鼠的遗传分化影响不是主要因素。

4 致谢

感谢中国科院内蒙古锡林郭勒草原生态系统国家野外观测研究站，中科院动物所农业虫害鼠害国家重点实验室张强博士和郑州大学谢东明研究生在样品采集过程中的帮助。

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