饲料中黄曲霉毒素B1快速筛查胶体金免疫层析检测方法应用研究

刘晓玥+侯亚楠+吕丽卿

摘要：本文介绍饲料行业中黄曲霉毒素B1目前检测方法的整体情况，并对优缺点进行分析，通过用胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附法对饲料样品的检测进行对比，结果表明：胶体金免疫层析试纸条法与酶联免疫吸附法相符率可达95%以上，胶体金免疫层析试纸法操作简单、快速、方便，可以应用于谷物及饲料产品黄曲霉毒素B1现场快速检测。

关键词：黄曲霉毒素B1；胶体金免疫层析法；试纸条；快速检测

中图分类号： R155；TS264 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.018

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）属于真菌毒素（Mycotoxin），主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生，广泛存在于土壤、灰尘、植物及其果实上，常见于花生及其制品、玉米及其玉米副产物、棉籽以及一些坚果类食物和饲料中（其中以花生和玉米污染最严重）。AFT包括B1、B2、G1、G2等10多种，其基本结构为二呋喃环和香豆素，其中AFB1占80%～90%，毒性最强。1993年AFT被直接卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为I类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏。世界各国对黄曲霉毒素在食品和饲料中限量要求。对于饲料企业每年收购玉米均以千吨来计，故黄曲霉毒素B1的筛查就显得尤为重要，它要求采用的检测手段，快速、准确、灵敏、易操作、设备投入小，通用型强等条件。

1 饲料检测标准概述

纵观有关黄曲霉毒素B1检测国家标准规定的方法10余个之多，涉及到的行业有食品、乳制品、粮油、饲料行业，本文重点介绍饲料行业现行的国家标准共计6个，见表1。

根据试验原理分为两类：一类方法是对样品进行快速筛查的定性和半定量方法；另一类方法是对样品进行定量检测的方法。

2 检测方法优缺点概述

2.1 薄层色谱法——半定量法（TLC）

该方法的特异性较差，样品中的其他荧光物质容易对检测物质产生干扰，从而影响检测结果的准确性，重复性较差。

2.2高效液相色谱法（免疫亲和层析柱）（HPLC）

该方法由于抗体的专一性，黄曲霉毒素B1被交联在层析介质中，因此方法专一性较强，实验过程繁琐，容易产生各种影响因素，造成检测物质损失，仪器设备昂贵，要求操作人员具有专业高效液相色谱经验，降低了推广性。

2.3 荧光光度仪

简单快速，灵敏度高、具有特异性。安全，不需要直接接触黄曲霉毒素，不用毒素标样，较少使用有机试剂。缺点：只能测出黄曲霉毒素的总量，不能分别测出其中B1、B2、G1、G2的含量；所用的水、试剂、仪器要求较高，水必须是高纯水或重蒸水，试剂必须是分析纯；需要专业仪器支持。

2.4时间分辨荧光层析法

灵敏度高，原理同ELISA一致，灵敏度和测量范围方面，均超越了市场上常用ELISA，有较好的分析稳定性，具有很好的应用前景，但同时检测过程比较复杂，所用试剂较多，需要使用标准品，给操作者带来风险，同时需要有专业仪器支持，故设备投入需要较多资金。

2.5 酶联免疫吸附法（ELISA）

该方法灵敏度高，分析速度快，简化了提取和纯化的步骤，其作为液相色谱法的初筛工具，不需要大型設备，对操作人员要求也不高，成本也相对较低，被广泛推广采用。

2.6胶体金免疫层析法 （GICA）

该方法灵敏度高、分析速度快、特异性强、稳定性好、操作简单、无需任何专业仪器设备，无需接触标准品，而且结果判断直接可靠、容易被基层单位人掌握，最早广泛应用于临床诊断及药物检测等领域，近年来在谷物中毒素检测领域被广泛使用，作为谷物快速毒素筛查工作起到了十分重要的作用。

3 胶体金免疫层析法详解（GICA）

3.1方法原理

这是20世纪80年代发展起来的一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和色谱层析技术相结合的快速检测分析方法。该技术本质是免疫检测技术，但充分利用胶体金作为示踪标记物的优点。通常为双抗夹心法和竞争法两大类，其中竞争法又分为比色法和消线法两种检测。由于真菌毒素均为化学结构简单的小分子，通常只需要1个表面决定小分子检测，如激素、真菌毒素、抗生素的检测等。所以，目前市场上胶体金免疫层析检测试纸条绝大多数采用竞争法的原理进行检测。

3.2 制备方法

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗鼠抗驴分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明，黄曲霉毒素 B1快速检测试纸条的灵敏度为 5ng/ml，检测时间为 10分钟，批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0。

3.3适用范围

玉米、小麦等谷物类样本，玉米副产品、饲料样本等。

3.4技术指标

玉米、小麦等谷物类样本最低检测限：10цg/kg（ppb）。

玉米副产品、反刍饲料等样本最低检测限：20цg/kg（ppb）。

3.5注意事项

试剂板一次性使用；不要使用过期试剂板，废弃物应妥善处理；请勿触摸试剂板中央的白色膜面；切勿重复使用配备的滴管，以免交叉污染；切勿食用配备的试剂。

3.6特异性

本产品与粮油中玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇没有交叉反应。

3.7精密度

同时使用本产品和黄曲霉毒素B1的ELISA检测试剂盒对300份样品包括161份阴性样本和139份阳性样本进行检测，结果表明，本产品与黄曲霉毒素B1的ELISA检测试剂盒的结果符合率为98.8%。

4 数据对比

在实际工作中通过大量样品对比，将胶体金免疫层析试纸检测法和酶联免疫吸附法进行对比，检测数据见表2。

表2 谷物原料和饲料产品黄曲霉毒素B1检测数据对比

通过上述数据对比，可以表明谷物原料和饲料产品使用胶体金免疫层析法检测，结果具有很好的稳定性，与酶联免疫吸附法的检测结果一致。

5结论

胶体金免疫层析法优于酶联免疫吸附测定法，具有假阳性率低、操作步骤少、操作过程影响因素少、测定结果重复性较好的优势，因此提高了检测效率，能满足企业在现场快速筛查的需要。此外，高色素复杂基质的谷物采用酶联免疫吸附法时容易出现假阳性，受样品基质影响明显，而样品基质对金标免疫层析试纸法影响不明显。虽然目前此方法还只能完成定性或半定量检测任务，但作为一种快速筛查手段，可以有效地对谷物原料进行进厂后的初筛过程，其稳定性、安全性完全可以满足企业对原料毒素控制要求，具有很重要的实际应用价值。

参考文献

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[3]邓省亮，赖卫华.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究[J].食品科学，2007，28（02）：232-236.

作者简介：刘晓玥，本科学历，副高级工程师，研究方向：饲料品控管理；侯亚楠，化验员，研究方向：饲料原料及产品毒素检测；吕丽卿，本科学历，化验员，研究方向：饲料原料及产品毒素检测。endprint