固相萃取HPLC法测定保健食品中的阿魏酸含量

马桂娟+朱燕燕

摘要：建立固相萃取HPLC法测定保健食品中阿魏酸含量的检测方法。样品中阿魏酸经甲醇-甲酸（95∶5）提取后，经Dionex OnGuard II RP柱净化。以1%乙酸溶液—甲醇（55∶45）为流动相，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4. 6 mm×5μm）分离，用DAD检测器在320 nm波长处检测，外标法定量。结果表明：阿魏酸的线性范围在5～50μg/mL，样品平均加标回收率在96.6%（n=6），RSD小于5%，最低定量检出限为0.3 mg/100g。该方法具有快速、灵敏、简便、准确等优点，能满足实际工作的需要。

关键词：固相萃取；高效液相色谱；保健食品；阿魏酸

中图分类号： R97 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.019

阿魏酸具有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗病变和防癌等作用[1]，是用于改善免疫力、缓解体力疲劳类保健食品的功效成分，其质量状况直接关系到人们的身体健康。目前，国家尚未制定保健食品中阿魏酸检测的国家标准、行业标准，有关阿魏酸的检测方法大多是药材和中成药中阿魏酸含量的检测[2-5]。但由于保健食品种类繁多，成分复杂，干扰因素多，在前处理方面与药物制剂和药材有很大不同。本文对样品预处理进行了改进，建立了采用固相萃取HPLC法测定保健食品中阿魏酸的快速、灵敏、准确的检测方法，并用于实际样品的监测，获得了满意的结果。方法回收稳定，精密度好，为保健食品的安全监管提供便利。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪（1260）：美国Agilent公司；萃取柱（Dionex OnGuard II RP柱，2.5cc）：美国Thmero公司；离心机（3K15）：Sigma 公司；氮吹仪（EVA50A）：北京普利泰科仪器有限公司；分析天平（BT25S）：赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 试剂与材料

对照品阿魏酸：中国药品生物制品检定所；甲醇：色谱纯，美国 FISHER 公司；甲酸：色谱纯，美国Sigma公司；乙酸：色谱纯，美国Sigma公司；超纯水：由Milli-Q 超纯水系统制备，其他试剂均为分析纯；样品：市售某品牌鹿胎盘胶囊。

1.3 方法

1.3.1色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6mm×5μm）；柱温：25 ℃；洗脱方式：1%乙酸溶液-甲醇（55∶45）为流动相等度洗脱；流量：1.0mL/min；檢测波长：320 nm；进样体积：10μL。

1.3.2标准溶液配制 准确称取适量的阿魏酸标准品，用流动相配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，以流动相逐级稀释配制5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL系列浓度的阿魏酸标准使用液。

1.4样品处理

1.4.1样品提取 精密称量样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入30mL甲醇—甲酸（95∶5），涡旋震荡2min，然后以8000r/min离心5min，待净化。

1.4.2 样品净化 采用Dionex OnGuard II RP柱（2.5cc）净化，RP柱用10mL甲醇活化放置10min后使用，取待净化清液过RP柱（弃去前5mL滤液），准确移取2.0mL净化液氮吹至干，然后用流动相定容至2.0mL，经0.22μm有机相滤膜过滤后供液相色谱分析。

2 结果和讨论

2.1 检测波长的选择

通过对100μg /mL的阿魏酸进行200～400nm范围的紫外扫描，结果发现阿魏酸在320nm有最大吸收。本文选择320nm为检测波长。图1阿魏酸标准溶液200～400nm光谱图。

2.2 流动相的确定

在ZORBAX Eclipse XDB-C18柱上用甲醇——水作流动相分离保健食品中阿魏酸，阿魏酸峰型差。根据阿魏酸的化学性质，考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。改用1%乙酸溶液替代水可以改变阿魏酸峰型，且能较好地与干扰杂质分离，图2中峰1（tR=5.34 min）为阿魏酸标准溶液的色谱峰，图3是样品中阿魏酸色谱图（tR=5.32 min）。

2.3 提取方式的确定

据文献报道，用甲醇∶甲酸（95∶5）作溶剂，阿魏酸稳定性良好[6]。本试验采用振荡提取、超声抽提、漩涡提取等不同提取方法进行研究， 实验结果表明，称取样品约2.0g于50mL具塞离心管中（3份），准确加入30mL甲醇∶甲酸（95∶5），分别振荡提取12h， 超声提取20min，漩涡提取2min，静置，取上清液过Dionex OnGuard II RP柱（2.5cc）净化后，色谱条件下进样10μL，结果见表1。

由表1可知，振荡提取12h，超声提取20min，漩涡提取2min，含量基本无变化，因此为提高检测效率选用漩涡提取2min。最优提取阿魏酸条件是提取溶剂甲醇∶甲酸（95∶5）、提取方式漩涡提取2min。

2.4 固相萃取柱的选择

保健食品多属于中药复方产品，含有多种提取药材，功效因子相互干扰，功效成分不易分离、定量测定。本文使用Dionex OnGuard II RP柱固相萃取柱是利用固体吸附剂将样品中的弱极性干扰物，如脂肪等保留，从而得到纯净的溶液，达到有效去除保健食品中杂质的目的。实验表明，经能获得较好的回收率，故采用Dionex OnGuard II RP柱作为样品预处理柱。

2.5回收率与精密度

精密量取2.0g同一浓度样品6份，每份加入浓度为0.50mg/mL对照品溶液0.6mL，按文中1.4项的操作方法进行处理与测定，并与标准曲线同时进行，以当时的标准曲线计算样品的测得浓度，求得本法的精密度与回收率，数据见表2。结果表明，有较好的回收率与良好的精密度，平均回收率为96.6%，其RSD为3.2%。endprint

2.6 线性范围和检测限

本方法的线性范围为5.0μg/mL～50μg/mL。配制5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL阿魏酸标准溶液，在选定的仪器条件下进行色谱分析，每个浓度点重复测定3 次，测得峰面积平均值对浓度绘制标准曲线。

图4 标准曲线数据显示，阿魏酸在5.0μg/mL～50μg/mL表现出良好的线性关系，计算回归方程为 Y=41.09X-5.29，相关系数为 r=0.9996。

以3 倍基线噪音所相当的待测物质的量计算，当取样量为2g，进样量为10.0μL时，保健食品中阿魏酸的检出限为0.3mg/100g。

2.7 样品测定结果

利用此方法对某品牌鹿胎盘胶囊进行检测，结果为32.67mg/100g。

3 结论

应用固相萃取HPLC法测定保健食品中阿魏酸含量具有灵敏度高、精密度和准确度好等优点，可作为保健食品中阿魏酸含量分析的检测方法。Dionex OnGuard II RP柱具有良好的吸附性能，能有效去除样品中的弱极性干扰成分，获得较好的回收率、重现性和较低的检出限。本方法简单、快速、经济，能够满足保健食品中阿魏酸的监测需要，适用于实验室批量检测分析。

参考文献

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作者简介：马桂娟，硕士，工程师，研究方向：食品检测。endprint