青海鹅观草属10个野生种质资源酯酶同工酶分析

李淑娟+李长慧+张英+刘艳霞

摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳（PAGE）技术对青海鹅观草属10个野生种质资源进行酯酶同工酶（EST）检测和分析。结果表明，鹅观草属10个种质的酯酶同工酶谱带共有9条，形成4个区域（A、B、C、D），其中Rf值为0.198、0.469、0.630的这3条酶带为共有带，其余则为各份材料的特征带；各种质材料间的酯酶同工酶表现出较丰富的多态性，说明鹅观草属10个种质不同种及部分种的不同居群在遗传本质上是有区别的。聚类分析表明，鹅观草属10个野生种质资源可聚为3个类群。

关键词：鹅观草属；种质资源；酯酶同工酶；聚类分析

中图分类号： S543+.202文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0024-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-24

基金项目：青海省科学技术应用基础研究计划（编号：2014-ZJ-712）。

作者简介：李淑娟（1967—），女，青海贵德人，硕士，教授，主要从事牧草种质资源与遗传育种研究。E-mail：lsjqhu@163.com。

[ZK）]

鹅观草属（Roegneria C. Koch）为小麦族（Trit-iceae Dumortier）近缘属中植物种类最多的多年生大属，现有120多种，我国有70多种[1]。该属许多物种是草原或草甸的组成成分，而且许多种类可作为优良牧草加以利用，也有部分种类含抗逆基因，可作为麦类作物培育新品种的宝贵资源。目前仅青海省鹅观草属植物就有23种、3个变种，广泛分布于三江源、祁连山地的大部分地区。其中的多数种具有抗寒、耐旱、耐盐碱、耐贫瘠等优良特性，是高寒地区天然草场的重要组成成分和优良的牧草，也是高海拔地区人工草地建设、草地改良、水土保持以及生态环境建设的首选草种。然而，鹅观草属植物种间由于形态特征较为相似，可作为分类依据的器官结构较为细微，其分类在禾本科中一直属于难度较大的属。

同工酶是一种特异蛋白质，是基因的直接产物，同工酶的差异反映基因的表达差异[2]。同工酶作为一种便捷的分子标记，广泛应用于生物学研究的各个领域，如探讨物种的起源进化、了解植物居群的遗传结构、研究种内遗传多样性等，在植物的种群、发育及遗传研究中，尤其对其种间分类及亲缘关系的研究有重要意义[3-9]。采用同工酶分析技术对种间、品种间的分类研究已比较广泛，其方法、技术较为成熟。从目前的研究来看，尚未有学者对于分布在青海地区的鹅观草属植物从生化水平上进行研究。本研究采用酯酶同工酶技术对分布于青海三江源区的鹅观草属10个野生种质资源6种[玉树鹅观草（Roegneria yushuensis）、毛穂鹅观草（Roegneria trichospicula）、短柄鹅观草（Roegneria brevipes Keng）、曲芒异芒草（Roegneria abolinii var. divaricans Nevski）、紫穂鹅观草（Roegneria purpurascens Keng）、肃草（Roegneria stricta Keng）]及部分种的4个居群进行酶酯同工酶谱带特征分析，从生化水平探讨不同材料间的遗传差异，为该属材料的选择利用及亲缘关系判定提供科学依据，这也是对该生态草种进行深入研究及合理开发利用的基础。

1材料与方法

1.1供试材料

本试验所采用的鹅观草属10份野生种质材料种子均采自青海三江源地区，于2015年5月种植于青海大学农牧学院草业科学系牧草试验田，待供试材料生长至幼苗期采集幼叶作为试验材料。其编号、物种名称及采集地等信息见表1。

1.2方法

1.2.1酶提取液制备分别称取10个试验材料的叶片（幼叶）各1 g，洗净后用滤纸吸干水分，剪碎后置于预冷的小研钵中，加入少量提样缓冲液，在冰浴中研磨匀浆，移入离心管中，10 000 r/mim、4 ℃，离心15 min，取0.5 mL上清液，加入等量的样品处理液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳（PAGE）电泳采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳技术[10]，分离胶浓度为7.5%，缓冲液pH值为8.8，浓缩胶浓度为3%，缓冲液pH值为6.8，凝胶厚度为1.5 mm。电极缓冲液为Tris-Gly缓冲液（pH值 8.3），上样量每槽为20 μL。电泳时，电流20 mA，浓缩胶电压为200 V，分离胶电压为220 V，温度4 ℃左右，恒压电泳至溴酚蓝迁移到距凝胶末端1.0 cm处为止。

1.2.3染色、固定及照相电泳结束后，采用醋酸萘酯-固兰RR盐染色法染色[11]，室温下染色至酶带清晰为止，用水漂洗终止染色，用7%冰乙酸固定5 min，清水漂洗后观察结果并拍照记录。

1.2.4酶带分析及数据处理根据相对迁移率Rf绘制模式图并标定酶带位置[12]：

Rf=酶带的迁移距离/前沿指示剂（溴酚蓝） 的迁移距离。

根據同工酶胶板上的谱带分布确定带的有无，并转化成二项数据，在同一Rf值处，有谱带的记为1，无谱带的记为0。把同工酶谱信息处理为0、1数据后，采用NTSYSpc-2.10s 统[CM（25]计软件用非加权组平均法（UPGMA）[13]分析10份材料的酯酶同工酶连锁类群，构建酶谱聚类树状图，进行聚类分析。

2结果与分析

2.1酶带及酶谱分布特征

谱带的数量、出现位点是判断区分不同种和品种的直观依据。由图1、表2可知，供试的10个种质材料的酯酶同工酶酶谱共55条酶带，鹅观草属10个种质的酯酶同工酶谱带共有9条，形成4个区域（A、B、C、D），每份材料显示的酶谱带5～6条不等。把它们分成A、B、C、D 4个区，其中A区为慢速迁移区，有1条酶带，Rf值为0.198；B区为中速迁移区，酶带数2～3条不等，Rf值在0.259～0.469之间；C区为较快速迁移区，Rf值为0.630，也仅有1条酶带；D区为快速迁移区，酶带数1～2条不等，Rf值在0.765～0.889之间。endprint

由图2可以看出，10 个种质材料中种间酯酶同工酶酶谱具有一定的差异，主要表现在酶带数、酶带迁移率、酶带的活性强度上。A、B、C区内都有各自的公共带，其中A1、B4、C1是10 个种质材料的共有带，酶带相对稳定，酶活性较强，其余酶带则为各份材料的特征带，说明酯酶同工酶谱带表现出较强的多态性。A区的公共带Rf=0.198，B区的公共带Rf=0469，C区的公共带Rf=0.630。从总体趋势看出，D区酶的活性最强，其次是B区，C区的活性最弱。

从同种的不同居群间酶谱来看，同为玉树鹅观草的R1、R5 2个居群各自的酶带数、酶带迁移率及酶带的活性均大致相同，R2在B1位点表现有特征带，与R1、R5的酶谱有差异，表明在遗传上存在分化；同为短柄鹅观草的R6、R9 2个居群的酶带数相同，但酶带的活性不同，R6仅D2 1条强带，R9有2条强带，其酶活性及含量均强于R6；曲芒异芒草R3、R7 2个居群酶带数相同，R3有2条强带，在D3位点有特征带，R7只有1条强带，R3、R7的酶谱有明显差异。可以看出，各种间不仅酶带总数不同，而且在各个区域分布的位点、带级也明显不同，而同一物种的不同居群间酶谱既具有较稳定的相似性，又具有細微差异。

2.2酯酶同工酶酶谱相似系数聚类

从表3可以看出，鹅观草属10个种质资源的遗传相似系数在0.167～1.000，其中R1与R5的相似系数最高，说明它们的相似性最高，基本没有遗传分化；而R3与R9的相似系数最低，仅为0.167，说明它们的相似性最低，二者的亲缘关系很远。所有样品在聚类距离约0.65处可分支为3个类群，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类；在第Ⅰ类群中，R1、R2、R4、R5、R10亲缘关系一致；在第Ⅱ类群中，R6、R7、R9亲缘关系较近；在第Ⅲ类群中，R3、R8亲缘关系较近（图3）。

3讨论与结论

魏秀华等利用同工酶技术研究鹅观草属的3个物种的生物系统关系，解决了这3个物种的划分问题[14]。本研究中鹅观草属的曲芒异芒草（R3）与玉树鹅观草（R2）、毛穗鹅观草（R4）、短柄鹅观草（R6）及紫穗鹅观草（R10）在酯酶同工酶谱带上存在不同程度的差异，各种间不仅酶带总数不同，而且在各个区域分布的位点及带级也明显不同，其遗传一致度较低（0.167～0.333）。玉树鹅观草的2个居群（R1、R5）及短柄鹅观草的2个居群（R6、R9）的遗传一致度很高（1000），但酶带的活性具有一定的差异性。同为玉树鹅观草的R2居群则与其他2个居群（R1、R5）在谱带分布上也有所不同，遗传相似度为0.833。居群之间具有相同或不同的酶带数，或者迁移率之间差异很小，可以认为它们既有共同的遗传基础，而且随着时空的变化又有变异的表现。这与前人的相关研究结果相似，即种子植物属内种间的遗传一致度约为0.67，种内居群间的遗传一致度约为0.90[15]。

基于遗传相似系数的酶谱树状聚类结果显示，种源相同、地理位置分布较近、海拔近似的鹅观草属植物如R1、R2、R4、R5、R10聚为一类；曲芒异芒草的2个居群R3、R7并未聚在一起，而是海拔较高的R7（3 200 m）与R6、R9聚为一类，海拔较低的R3（2 500 m）、R8（2 700 m）2个居群聚为一类。说明鹅观草属植物的聚类与种源地、海拔、生境有一定关系，海拔差异小的居群遗传距离也较小。

鹅观草属10个种质资源的酯酶同工酶酶谱类型丰富，酶带数量、带级、位点及活性强度等表现出一定差异，各自具有特征谱带，且所具有的共有带的带级、酶含量、活性强度也不尽相同，说明利用这些酶谱特征找出供试材料间的细微差异是可行的，由此表明，供试材料具有独立的遗传关系，之间有一定的遗传分化，是进行生化水平鉴定的有利指标。酶谱分析作为揭示物种遗传背景的方法，还受生理、发育状态及人为等因素的干扰，所以应该将其与其他方法包括形态学、细胞学等方法结合起来才能得出更加准确可靠的结果[16]。对该属植物采用其他种类酶[如过氧化物酶（POD）同工酶、细胞色素氧化酶]分析，尚待进一步研究。

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