反相高效液相法分析罗汉果皂苷V

李飞妍++黄玲++万红丽

基本知识

（1）皂苷V的基本知识

皂苷是罗汉果中的一种非糖甜味成分，为极性较强的大分子化合物，不易结晶，易溶于水和醇，难溶于有机溶剂，具多种生物活性。

皂苷V（又称甜苷V）易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，不溶于石油醚、氯仿等低极性有机溶剂。

（2）反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的分离机理

RP-HPLC是高效液相色谱法中较常用的分离方法，其机理是采用流动相极性大于固定相的流动相来分离含极性官能团的有机化合物；分子在反相色谱柱中是按其极性的大小移动，极性越大被洗脱出越快；

选题意义及国内外发展状况

近年，甜苷类化合物越来越吸引人们注意，而目前我国对罗汉果皂苷提取物的分离、纯化以及含量测定的研究依然极少。

皂苷V是甜苷中的主要甜味成分，罗汉果甜苷类产品质量一般以罗汉果皂苷V的含量来评价。故对皂苷V提取和含量分析具重要的意义。

反相高效液相色谱法测定罗汉果中皂苷V的含量

实验用品。

（1）材料

罗汉果干果；罗汉果甜苷V标准品来源：中国药品生物制品鉴定所；纯度（R）：100%

（2）主要试剂

乙睛（色谱纯）、蒸馏水、甲醇（分析纯）、乙醇（分析级）

（3）使用仪器

高效液相色谱仪、电子天平、粉碎机、紫外-可见分光光度计、多用途恒温超声提取机、电热恒温干燥箱

实验步骤。

（1）罗汉果的预处理

将罗汉果干果粉碎成粉末后，置于60℃左右干燥箱中，干燥4h后密闭保存，备用。

（2）提取方法的确定（常规水煮法、超声法和加热回流的比较）

经过查阅超声、常规水煮及加热回流提取罗汉果中甜苷V的相关资料，在各方法最佳条件下：常规水煮法对罗汉果甜苷的提取率为2.43%，而罗汉果甜苷的含量在3.76～3.86%范围内，故提取不完全；超声法（3.59%）和加热回流法（3.55%）对罗汉果甜苷的提取率差不大，而加热回流法对罗汉果甜苷的最佳提取所用的时间是超声法的4倍，且繁琐复杂。从而确定超声法为本实验的提取方法。

（3）对照品溶液的配制

精密称取皂苷V标准品10.34mg，用23%的乙睛定容于50ml容量瓶中，配制成0.2068mg/ml的对照品储备液。

（4）样品溶液的制备

（5）波长的选择

将制好的皂苷V对照品溶液和樣品溶液于分光光度计下进行波长测定，发现2者在203nm处吸收峰均为最大，故令检测波长为203nm。

（6）色谱体系的确立

①色谱柱的选择

罗汉果中含有多种三萜皂苷类化合物，具相同苷元，结构类似，极性极相近，其区别仅在于所连接的葡萄糖基不同；而-NH2为碱性，具强氢键结合能力，对某些多官能团化合物具好分离。故选氨基柱为检测的色谱柱，通过氨基键合相上的-NH2与糖类分子中的-OH间选择性相互作用，从而使皂苷达到很好分离效果。故采用NH2柱作为实验的色谱柱，使罗汉果皂苷被有效洗脱

②流动相的确定

由于高效液相色谱中所用的流动相为液体，组分在流动相中受到亲和力的作用。故对组分的分离度，流动相起很大影响；经由查阅相关资料，乙睛-水溶液对罗汉果皂甙分离效果较好：本文研究了20%～25%的乙腈水溶液对罗汉果甜苷分离效果。发现各色谱峰能较好分离所用乙腈水溶液为23%。低于23%的乙腈水溶液为流动相时，洗脱能力低，主峰与杂质峰重叠现象严重；随着乙腈-水溶液的浓度增加（由23%→25%）时，分析时间↓，洗脱能力↑，但分离时间延长，甚至主峰不出现。

综上，可确定23%乙腈水溶液为本实验的流动相。

③色谱的分析条件

色谱柱：Shodex Asahipak NH2柱（4.6mmID×250mm 5um）；流动相：乙腈水溶液（乙腈：水=23：77），用氨水调pH=7.0；流速v=1.2mL/min取波长λ=203nm进行检测；进样量：10.000μL；定量方法：外标法；检测灵敏度：0.08；柱温：22.5℃；柱压：1.0MPa；湿度：59%。

（7）罗汉果甜苷V色谱峰的判定

本实验利用甜苷中分子极性差异来分离出罗汉果甜苷V，极性大的先出，极性小的后流出。对应标准品色谱图，由保留时间来判断出样品的色谱峰。甜苷提取物在RP-HPLC柱中进行分离时，罗汉果苷均在皂苷V前出。故罗汉果各苷对皂苷V的分离纯化无大的影响。

（8）系统适用性试验

按2.2.6条件下，精密吸取10.000?L的皂苷V对照品溶液和样品溶液各一份，进行高效液相色谱仪的测定。结果：皂苷V在色谱柱上的tR=10.5min。皂苷V与其相邻杂峰实现了基线分离，分离度R>1.5，对照品溶液与样品液得到了充分的洗脱和良好的分离。按罗汉果苷V峰面积的理论塔板数N≥5000。

（9）回归方程

准确吸取皂苷V对照品溶液（0.2068mg/ml）的2?L、5?L、10?L、30?L、50?L分别进样，结果为：回归方程Y=45.779+0.7406（n=5），相关系数r^2=0.9999，罗汉皂苷V进样量在2～50?L内与峰面积具很好线性关系，即皂苷V含量的线性范围为0.4172～10.4300 ?g。

（10）样品测定

精密吸取皂苷V样品溶液10.000μL，进样，在2.2.6条件下平行测定3次，皂苷V浓度（C/mg·ml-1）分别为0.16023、0.1605、0.1560，对应的皂苷V的色谱峰面积（mAU·s）分别为355.5632、356.0322、354.7482，罗汉果质量为0.5M/g，计算所含皂V的含量（%）分别为1.6507、1.6529、1.6469，即皂苷V的平均含量为1.6502%。

质量标准分析方法验证。

（1）精密度考察

精密吸取对照品溶液，连续进样5次，每次10?L，在2.2.6条件下测定，记录皂苷V的峰面积（mAU·s）分别为458.2954、455.1334、450.0102、454.9787、456.2344，平均值454.9304；相对标准偏差RSD（%）为0.6710%（n=5），表明本实验所用的仪器具良好精密度。

（2）稳定性试验

取同一样品溶液，隔60min进样一次，平行5次，按2.2.6条件测峰面积，进样时间/min为0、60、120、180、240分别对应的峰面积（mAU·s）为358.0511、354.9897、360.1955、353.1956、357.0984；平均为356.70606 mAU·s

由结果，可知待测组分在0～240min内，色谱峰面积未明显改变，经计算，RSD为0.7601；则被测物在0～240min内保持稳定。

（3）重复性试验

按“2.2.1”预处理，精密称取0.5g粉末，共6份。分别按“2.2.4”制备甜苷V供试品溶液，按“2.2.6”条件进样（每次10?g）；HPLC法测定并计算含苷V的含量，得到RSD 0.5457%，说明本实验所用的分析罗汉果甜苷V的方法重复性高。

（4）考察加样回收率试验

称取一定量的含量为1.6502%的罗汉果干果按“2.2.1”预处理；精密称取干燥的罗汉果粉约0.45g，共6份；每份按“2.2.4”法制备供试品溶液后，分别精密加入4mL的 0.2068mg/ml甜苷V对照品溶液，再按“2.2.6”项测定其含量，所得平均回收率为99.1301%，相对标准偏差为0.6126%，故本实验回收率好，准确度高。

结论

（1）从常规水煮、超声法和加热回流3种提取法中，确定超声提取罗汉果甜苷是最有效的：以甲醇提取，料液比1：30，功率800W，频率26.8KHZ，常温提取约30min。该法很大程度提高了罗汉果甜苷的提取率与提取速度。

（2）用Shodex Asahipak NH2柱分离罗汉果甜苷V，为制备甜苷V对照品的提供很好途径。

（3）以NH2柱为色谱柱的基础上，建立了RP-HPLC法分析罗汉果甜苷V【色谱柱：Shodex AsahipakNH2柱（4.6mmID×250mm 5um）；流动相：乙腈水溶液（乙腈：水=23：77），用氨水调pH=7.0；检测波长：203nm；流速：1.2mL/min；進样量：10.000μL；检测灵敏度：0.08；柱温：22.5℃；柱压：1.0MPa；湿度：59%。】

（4）本文所建立的RP-HPLC法，系统适用性好，可使皂苷V与其相邻杂峰实现了基线分离，并得到充分洗脱和良好分离，通过主要色谱峰洗脱液收集，再浓缩、重结晶冷和冻干燥，可得到皂苷V的白色结晶粉。

（5）本文所建立的定量分析皂苷V的RP-HPLC法精密度、准确性好，重现性、回收率高，且样品前处理较易，提取与检测时间较短，故可用于罗汉果及其制品中罗汉果甜苷V的分析，从而有效进行甜苷V的含量测定及质量评价。