苦豆子愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系的建立

高媛　孙牧笛　徐全智

摘要：以苦豆子子叶和胚轴为材料，对苦豆子愈伤组织诱导和继代增殖的最佳培养条件进行研究，旨在建立苦豆子悬浮细胞体系。结果发现，子叶和胚轴为愈伤组织生成的最佳外植体，愈伤组织最佳诱导培养基是MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳继代增殖培养基是MS+1.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D。以胚轴诱導的愈伤组织是细胞悬浮培养的理想材料，初始接种量10%～20%，添加3%蔗糖，有利于悬浮细胞体系的生成。

关键词：苦豆子；愈伤组织；悬浮培养；子叶；胚轴；诱导培养基；继代增殖培养基；初始接种量

中图分类号： S567.904.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0027-04

苦豆子（Sophora alopecuroides）豆科槐属，是我国西北荒漠区广泛分布的一种重要沙生药用植物[1]，以全草、根、种子入药，味极苦，性寒，民间用其根治喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等[2]。喹诺里西啶生物碱和类黄酮是其重要的活性成分，已有研究报道，喹诺里西啶生物碱是一种安全无毒的生物杀虫剂，在医药上苦豆子具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫、增强免疫等多种生理活性[3]。通过刈割苦豆子植株提取有效活性物质是目前常用的方法，但苦豆子野生资源有限，且不利于人工栽培，势必造成野生资源枯竭，影响生态平衡[4]。因此，合理开发利用苦豆子资源是其长足发展的重要途径。

植物细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。目前，利用悬浮细胞培养来生产次生代谢物已广泛应用于各类药用植物中。1997年，许建锋等首次开展了高山红景天悬浮细胞培养[5]。2010年，姜新超对岷江百合进行愈伤组织的诱导时发现，悬浮细胞系建立的关键在于挑选适于悬浮细胞培养的愈伤组织[6]。2014年，赵继鹏等建立了曼地亚红豆杉细胞悬浮体系，发现接种量和激素配比起着至关重要的作用[7]。迄今为止，国内外有关药用植物悬浮细胞培养方面的研究越来越多，红豆杉、甘草、半夏等都有相关的报道[8-10]。关于苦豆子愈伤组织培养已有大量报道，但暂无人建立苦豆子悬浮细胞系。本研究以苦豆子发芽籽粒的子叶、胚轴和胚根为外植体，研究苦豆子愈伤组织诱导、继代增殖培养条件，建立苦豆子悬浮细胞培养体系，为进一步研究苦豆子悬浮细胞培养生产次生代谢产物奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

野生苦豆子豆荚采自宁夏灵武白芨滩国家自然保护区。

1.2方法

1.2.1愈伤组织诱导培养

1.2.1.1不同外植体对愈伤组织诱导的影响

挑选饱满、无病害虫蛀的苦豆子种子，80%硫酸浸泡2 h软化种皮，无菌水冲洗并浸泡2 h。用体积分数为75%的乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3次，5%次氯酸钠溶液浸泡10 min，无菌水冲洗3次，置于铺有无菌滤纸的培养皿中，温度为（25±2） ℃，暗培养24 h后，光周期为12 h/d，培养3～5 d催芽。将子叶、胚轴和胚根用灭菌刀划上切口后，接种于添加激素（0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D）的MS培养基上诱导愈伤组织。每种处理接种60块外植体，上述培养条件培养25 d后统计愈伤组织的诱导率，观察愈伤组织的生长状况。愈伤组织诱导率=诱导愈伤组织数/接种组织数×100%。

1.2.1.2不同激素配比对苦豆子愈伤组织诱导的影响

将子叶和胚轴分别接种于添加2，4-D（0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、05、1.0 mg/L）组成的26种MS培养基上，每个处理接种60块外植体，在温度为（25±2） ℃、光照时间12 h/d条件下培养25 d，统计愈伤组织的诱导率及其生长状况。

1.2.2愈伤组织的增殖培养

将生长旺盛的愈伤组织转接至添加2，4-D（0.2、0.5、1.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L）组成的7种MS培养基上进行增殖培养，计算愈伤组织的增殖系数并记录愈伤组织的生长状态。增殖系数=收获鲜质量/接种鲜质量。

1.2.3悬浮细胞系的建立

选用子叶诱导增殖培养4次的愈伤组织和胚轴诱导生成的愈伤组织，接种于含有“1.2.2”节筛选出的最佳激素配比的MS液体培养基中，100 mL锥形瓶中加入30 mL MS液体培养基，置110 r/min的恒温摇床上，在温度（25±1） ℃下黑暗培养12 h后，光照黑暗交替 12 h/d。每隔5 d继代1次，吸取约10 mL的培养物，接种到新鲜培养基中，连续培养2～3代，得到悬浮细胞。

1.2.3.1初始接种量对悬浮细胞系的影响

以胚轴诱导的愈伤组织为悬浮细胞系材料，按不同梯度接种量接种至添加最佳激素配比的MS液体培养基中，7 d后收获观察悬浮细胞的生长情况。

1.2.3.2不同浓度抗氧化剂对悬浮细胞系的影响

以胚轴诱导的愈伤组织为悬浮细胞系材料，分别添加质量浓度10、30、50 mg/mL的蔗糖以及10、20 mg/mL的维生素C，7 d后收获观察悬浮细胞的生长情况。

1.2.4悬浮细胞系生长量的测定

接种0.3 g悬浮细胞于培养液体积为30 mL的100 mL锥形瓶中，每2 d取样1次，每次取3瓶，将悬浮细胞培养液倒入布氏漏斗减压抽滤，抽干水分测定鲜质量，连续测定7次绘制生长曲线。

1.2.5悬浮细胞系pH值的测定endprint

每2 d取1次悬浮细胞培养液，用pH计测量其酸碱度的变化，并绘制pH曲线。

1.2.6悬浮细胞系蔗糖含量的测定

利用硫酸蒽酮法测定悬浮细胞系蔗糖含量，蔗糖标准曲线y=0.007 7x+0.024 4（r2=0996 5），线性关系良好。

2结果与分析

2.1不同外植体对愈伤组织诱导的影响

以子叶为外植体的诱导率高达88.3%，生长状态良好，愈伤组织呈嫩绿色，表面松软结构紧实；其次，以胚轴为外植体的诱导率为83.3%，组织膨大疏松，颜色浅绿或淡黄；以胚根为外植体的诱导率仅为23.3%，生长速度慢，分化困难，不易进行增殖培养（表1）。

2.2不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

NAA在苦豆子愈伤组织的诱导上起着重要作用，未添加NAA的愈伤组织生长情况并不理想，仅在子叶切口边缘长出愈伤组织，一般质地较硬，诱导效果不理想。添加0.1～0.5 mg/L NAA、1.5～2.0 mg/L 6-BA、0.5～1.0 mg/L 2，4-D，对苦豆子子叶愈伤组织的诱导效果较好，诱导率相对较高，说明NAA、6-BA、2，4-D激素组合容易诱导出愈伤组织。从诱导率及愈伤组织的形态和生长状况综合来看，诱导子叶愈伤组织的最佳培养基是MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，愈伤组织表面松软，质地紧实，呈淡绿色（表2）。此外，用上述培养基进行胚轴愈伤组织的诱导，诱导率高达100%，为质地疏松的淡黄色愈伤组织。

2.3愈伤组织的增殖培养

2，4-D在愈伤组织增殖生长过程中起着重要作用，未添加2，4-D的愈伤组织严重褐化。当6-BA浓度为 4.0 mg/L、2，4-D浓度为1.0 mg/L、NAA浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织的继代增殖系数达到2.4，愈伤组织质地疏松、颜色淡绿。从愈伤组织的形态、生长状况和增殖系数综合来看，最佳增殖培养基为MS+1.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA（表3）。

2.4悬浮细胞系的建立

以胚轴愈伤组织为材料（图1-A1），在MS+1.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培养基中培养后4 d起，培养液逐渐开始浑浊，呈现淡黄色黏稠状（图1-A2），镜检可观察到分散的细胞及正在分裂的细胞团（图1-A3）；而以子叶愈伤组织为材料培养悬浮细胞，前3 d细胞保持鲜绿色，7 d后悬浮细胞逐渐褐化死亡并聚集下沉。

2.4.1初始接种量对悬浮细胞系的影响

接种量为4.77 g时，7 d后悬浮细胞系净生长量最高达5.24 g，且悬浮细胞培养液自2 d起开始出现浑浊，逐渐变为淡黄色黏稠液体，显微镜检可以观察到大量分散性良好的细胞；其次为接种量 3.31 g，悬浮细胞系净生长量达3.59 g；接种量分别为1.62、7.53 g 时，悬浮细胞净生长量均较低（表4）。可见，当接种量在10%～20%时，有利于悬浮细胞体系的生成。

2.4.2不同浓度抗氧化剂对悬浮细胞系的影响

添加维生素C可在短时间内保持悬浮细胞系的鲜活状态，但会抑制其生长分化；添加10～50 mg/mL的蔗糖在一定程度上能防止悬浮细胞褐化，其中添加30 mg/mL的蔗糖效果最好，悬浮细胞系净生长量达 2.59 g（表5）。

2.5悬浮细胞系的生长特征

培养前2 d细胞鲜质量变化不明显，有一定延迟期。接种后3 d细胞迅速生长，8 d时细胞鲜质量达最大值，与培养初期相比增长约3倍，细胞生长进入稳定期（图2）。

2.6悬浮细胞系pH值的变化

苦豆子悬浮细胞在培养的前2 d，pH值较初始值有明显的下降，由5.6降至5.35，随着培养时间的延长，pH基本保持在5.3～5.5之间（图3）。

2.7悬浮细胞系糖含量的变化

悬浮细胞培养液中总糖浓度在培养前2 d出现急剧下降趋势， 由30 mg/mL降至10 mg/mL左右，随着培养时间的延长，培养液中的蔗糖逐渐减少，10 d后消耗殆尽（图4）。

3讨论与结论

在植物离体培养过程中，外植体的内源激素不断发生变化，向培养基中添加不同种类和浓度的生长调节物质，可以改变外植体的激素水平， 从而影响外植体的生长状况。基本培养基类型、外植体种类、激素水平等均影响着愈伤组织的诱导，其中激素水平对愈伤组织诱导的影响最为复杂[11]。本试验在已有研究基础上，开展了不同激素种类及配比对苦豆子愈伤组织诱导及继代培养的影响，并建立苦豆子悬浮细胞培养体系。苦豆子子叶和胚轴均适合诱导生成愈伤组织，以 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D激素配比效果最佳，其细胞组织状态及长势最好。在苦豆子愈伤组织诱导过程中，NAA是必不可少的，添加适量的NAA能促进细胞分裂与生长，诱导愈伤组织效果明显，但浓度不宜过高。一般情况下进行愈伤组织继代培养时，采用与诱导培养基即可使愈伤组织大量增殖，但也有研究指出继代培养须要适当调整激素配比，才能保证愈伤组织的增殖和生长[12]。本试验发现，2，4-D和6-BA在苦豆子愈伤组织继代培养中起着重要的作用，如不添加2，4-D愈伤组织容易褐化死亡，这可能与2，4-D和6-BA能有效加快植物细胞生长、延缓蛋白质和叶绿素降解相关[13]。本试验以MS+1.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D激素配比的愈伤组织继代增殖效果最好，愈伤组织生长旺盛，颜色为黄绿色，质地疏松，易分散。

建立良好的悬浮细胞培养体系是进行大规模细胞培养的必要准备，愈伤组织良好的松散性、较强的增殖和再生能力是细胞悬浮培养的前提条件。本试验采用苦豆子胚轴诱导愈伤组织，在诱导当代获得结构松散、单细胞比例高、分散性好的愈伤组织在MS+1.0 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA液体培养基中培养后2 d起，培养液开始浑浊，培养后4 d呈现淡黄色黏稠状，生长培养后8 d即可获得稳定的悬浮细胞系。这与徐世千等关于百里香悬浮细胞系研究的报道[12]相似。初始接种量是悬浮细胞培养过程中的重要指标，合适的细胞起始浓度，有利于相邻细胞的信号分子量在短时间达到细胞生长的需求。初始密度过高，细胞的快速生长会大量消耗培养基中的养分，导致细胞过早衰老，褐化死亡。初始浓度过低不利于细胞间信号传递，从而抑制细胞生长[14]。在进行苦豆子细胞悬浮培养过程中，初始接种量控制在10%～20%间，均可以获得较为稳定的悬浮细胞系。防褐化试剂可以有效抑制细胞的褐化，延長细胞的生长周期，且一些防褐化试剂可以促进细胞的生长和次生代谢物含量的提高[15]。蔗糖是细胞生长的重要碳源，适宜浓度的蔗糖能提高培养细胞的生长速率并防止褐化。在苦豆子细胞悬浮系培养中添加30 mg/mL蔗糖，有利于苦豆子细胞生物量增加并降低褐化率。苦豆子悬浮细胞的生长周期较短，约为10 d，液体培养基的pH值和蔗糖含量呈现一定的波动，生长前期pH值明显下降，可能与植物细胞快速吸收培养液中的氮素有关，pH值的下降为水解酶提供了适宜的环境[16]，使细胞充分水解培养液中的糖分，为细胞的生长和代谢提供能量。endprint

本试验通过对苦豆子愈伤组织的诱导及起始细胞密度和培养周期对细胞悬浮培养影响的研究，初步建立了苦豆子细胞悬浮培养体系，要获得更高产喹诺里西啶生物碱的苦豆子悬浮细胞系，碳源浓度、培养基成分及诱导前体等将是进一步试验要考虑的重要因素。

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