洋桔梗小孢子培养胚性愈伤组织诱导

贾茸　朱永平　江周

摘要：研究了影响洋桔梗小孢子培养中胚性愈伤组织形成的主要因素，旨在建立其高频胚性愈伤组织体系。结果发现，基因型是影响洋桔梗小孢子发生胚性愈伤组织的关键因素，不同基因型间诱导率不同，供试材料中3份诱导出胚性愈伤组织，其中香槟601出愈率最高，达到4.86个/朵；4 ℃低温处理1～3 d均能显著提高胚性愈伤组织的出愈率，最佳处理时间是1 d。32 ℃热激处理对于提高胚性愈伤组织出愈率有一定的影响，但较低温处理不明显。适合多个洋桔梗基因型诱导胚性愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

關键词：洋桔梗；小孢子培养；胚性愈伤组织；影响因素

中图分类号： S682.1+90.4+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0039-03

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）别称德州兰铃、草原龙胆、丽钵花，为龙胆科草原龙胆属的宿根草本花卉，原产于美洲墨西哥、美国中南部等地[1]。洋桔梗花色繁多，花姿优美，极具观赏价值，是世界花卉领域极具发展前途的品种之一。目前，我国的洋桔梗F1代种子都从国外进口，不仅价格高昂，而且后代分离严重，不能留种，给洋桔梗的商业化生产带来了较大阻碍。

洋桔梗常规育种耗时长，效率低，获得纯合自交系需要 6～8年自交与选择，而通过游离小孢子培养可以在短期内获得单倍体植株，快速纯合育种材料，缩短育种周期，加快育种进程[2]。目前游离小孢子培养技术已在甘蓝型油菜[3]、辣椒[4]、大白菜[5]、白菜[6]、水稻[7]、小麦[8]等作物成功建立了游离小孢子的培养体系，成为重要的育种方法，而迄今关于洋桔梗游离小孢子培养体系的研究还鲜有报道。

本试验研究了基因型、4 ℃低温处理、32 ℃热激处理、激素处理等4个因素对其胚性愈伤组织发生的影响，旨在建立较高愈伤组织诱导率的培养途径，为后期分化成苗提供足够多的材料，推进洋桔梗游离小孢子培养体系的快速建立，为单倍体育种奠定一定的基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验在2014年10月28日开始进行，于云南省农业科学院玉溪基地采摘红色401、粉色503、香槟601、蓝色601和蓝雾401等5个不同基因型洋桔梗，材料在大棚内种植，采用的是常规的田间管理。

1.2试验方法

1.2.1材料选择取样时间为晴朗天气的09：00—10：00，从生长旺盛的洋桔梗植株上采取绿色饱满、花萼与花冠等长或者花萼略短于花冠的新鲜花蕾。处于该形态特征的花蕾，其小孢子绝大部分处于单核靠边期，在前期的试验中已经证实了洋桔梗花蕾的该形态特征与其小孢子发育时期相关的这一特性。

1.2.2外植体处理洗洁精水清洗花蕾10 min，流水冲洗30 min，然后在超净工作台中用75%乙醇浸洗10 min，10.5% NaClO处理8 min，无菌水冲洗5 次，每次3 min，沥干水分，待用。

1.2.3小孢子提取、纯化用小镊子将花蕾剥开，取出花药，清理花丝，置于无菌研钵中，加入适量B5溶液，用研棒充分碾压花药，分离出小孢子，后在双层漏斗中加300目消毒滤网过滤，滤液收纳于5 mL离心管中，转速1 200 r/min，离心3次，时间分别为12、8、5 min，弃B5上清液，按每蕾加入3 mL相应MS液体培养液，将沉淀物摇匀，用移液枪取1.0 mL于MS固体培养基上，再加入2 mL相应MS液体培养液。

1.2.4试验设计试验从以下4个因素探讨其对洋桔梗小孢子诱导胚性愈伤组织的影响：

（1）不同基因型。以5个不同基因型的洋桔梗为试材，每3瓶接种1个花蕾的小孢子，在相同条件下进行培养，每个处理重复3次。

（2）4 ℃低温处理。接种前把部分洋桔梗的花蕾放在4 ℃冰箱中进行低温预处理，处理时间分别为1、2、3 d，以未经低温处理的洋桔梗为对照，每个处理重复3次。

（3）32 ℃热激处理。小孢子接种到瓶后，将其放在32 ℃恒温培养箱中进行热激处理，处理时间分别为1、2、3 d，以未经低温处理的洋桔梗为同一对照，每个处理重复3次。

（4）激素处理。以MS为基本培养基，添加6.5 g/L琼脂、30 g/L蔗糖。分别添加不同浓度的激素6-BA、KT、2，4-D和NAA，pH值调节到5.8，配制不同组合的愈伤组织培养基，每个处理重复3次，设计正交试验L9（34），结果见表1。

1.2.5数据分析所得数据采用SPSS软件进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1基因型对小孢子胚性愈伤组织诱导影响

供体植株基因型与小孢子愈伤组织的获得有密切关系。在供试的5个基因型中有2个基因型没有诱导出愈伤组织，3个基因型诱导出愈伤组织，诱导率占60%。其中，香槟601最先出现胚性愈伤组织且出愈率最高，达到4.86个/朵，单瓶最高产愈数为12个；粉色503出愈率达到2.59个/朵，而红色401较差，仅为0.98个/朵，单瓶最大只有3个。香槟601平均每朵花蕾出愈数是红色401的4.94倍、粉色503的1.88倍，而蓝色601和蓝雾401始终没有诱导出胚性愈伤组织，基因型间大体差异显著（表2）。表明洋桔梗基因型是影响其小孢子愈伤组织培养的一个重要因素。

2.24 ℃低温预处理对洋桔梗小孢子胚性愈伤组织的诱导影响

在接种前对洋桔梗花蕾进行4 ℃低温预处理获得的小孢子胚性愈伤组织比对照组多，说明对洋桔梗的花蕾进行一定时间的低温处理能提高小孢子愈伤组织发生频率。红色401、粉色503和香槟601分别在4 ℃低温条件下预处理1、2、3 d时均获得了胚性愈伤组织，均比未经处理的对照组的出愈率高，且以经4 ℃低温预处理1 d获得愈伤组织的概率最大。其中，红色401达到3.11个/朵，粉色503达到7.00个/朵，香槟601达到12.11个/朵，分别是对照的9.42、12.50、7.25 倍。随着处理时间的持续，低温处理有利于愈伤组织诱导的作用越来越不明显，处理3 d后，3种基因型的诱导率均下降（表3）。由此说明对洋桔梗花蕾进行一定时间的低温预处理是有必要的，且以处理1 d效果最佳。

2.332 ℃热激处理对洋桔梗小孢子胚性愈伤组织诱导的影响

32 ℃热激处理对洋桔梗小孢子胚性愈伤组织的获得有一定效果。热激1 d时，获得的胚性愈伤组织数低于对照，随着处理时间的延长，获得的胚性愈伤组织渐多，以处理3 d达到最大值，其中红色401愈伤组织率达到0.78个/朵，粉色503达到1.44个/朵，香槟601达到3.33个/朵，分别是对照的2.36、2.57、1.99倍（表4）。虽然热激处理对于提高愈伤组织诱导率有效果，但是与4 ℃低温预处理相比，差异较大。由此说明32 ℃热激处理对于洋桔梗小孢子胚性愈伤组织的影响不明显。

2.4激素处理对洋桔梗小孢子胚性愈伤组织率的影响

同一基因型的小孢子在不同激素处理上的出愈率以及不同基因型在相同激素处理上出愈率存在差异（表5）。红色401在5号激素处理上获得的胚性愈伤组织率最高，为2.43个/朵，在2号和4号激素处理中没有获得出胚性愈伤组织；粉色503出愈率最大是在5号激素处理上，达到6.86个/朵，在2号激素处理的诱导率为0；而香槟601在9种处理中均诱导出胚性愈伤组织，在5号激素处理中出愈率最大，达到886个/朵，在4号激素处理中最小，仅为2.14个/朵。

红色401小孢子诱导胚性愈伤组织的激素极差大小顺序为RC>RB>RD>RA，即影响愈伤组织诱导的激素大小顺序为2，4-D>KT>NAA>6-BA，其中2，4-D的k3最大，即浓度为2.0 mg/L；KT的k3略大于k2，考虑到成本，最佳浓度取1.0 mg/L；NAA的k2最大，浓度为0.2 mg/L；6-BA的k2最大，浓度为1.0 mg/L。由此确定红色401小孢子产生胚性愈伤组织的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，影响粉色503和香槟601胚性愈伤组织诱导的激素大小顺序分别为2，4-D>KT>6-BA>NAA和2，4-D>KT>NAA>6-BA，最佳培养基同为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA（表6）。由此说明虽然激素种类对洋[CM（25]桔梗不同基因型小孢子培养诱导愈伤组织的影响大小不一致，但在某一培养基配方中，不同基因型洋桔梗胚性愈伤组织的诱导均能达到经济、高效的结果。因此，筛选出适合洋桔梗小孢子胚性愈伤组织诱导的最佳激素组合为5号，即MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

3讨论与结论

供试材料的基因型是影响小孢子培养的主要因素之一，决定着小孢子培养中产生的愈伤组织的数量和质量，这一现象在多种作物的小孢子培養中普遍存在[9-10]。本试验供试的5个不同基因型洋桔梗材料中有3个诱导出愈伤组织，其他2个材料即便采取了不同温度、时间、激素组合等多种处理措施，也依旧无法诱导出愈伤组织，这可能是因为不同基因型洋桔梗材料的游离小孢子对离体培养的敏感度不同而产生的差异，有些材料容易得到愈伤组织，有些材料不容易或者不能得到愈伤组织，因而要特别重视对供体植株基因型的筛选。

已有研究表明，低温预处理花蕾，能从不同程度上促进胚性愈伤组织的诱导，这已经成为小孢子培养中普遍采用的一个重要步骤[11-12]。Duncan等发现，低温预处理不仅可以使花粉退化速度减慢，还能诱导更多花粉启动新的细胞周期，从而促使更多小孢子参与反应[13]。Burgin等分析认为，烟草花蕾经低温处理后，小孢子分裂指数显著上升[14]。本试验通过4 ℃低温预处理花蕾1、2、3 d获得的愈伤组织明显较对照多，其中以预处理1 d的效果最佳，随着处理时间的延续，得到的愈伤组织更少。可能是小孢子因长时间的低温预处理消耗过多营养以维持代谢，造成了自身活力的下降甚至死亡。因此，低温处理对诱导洋桔梗产生胚性愈伤组织有良好的效果。

董艳荣等认为，热激处理改变了小孢子的分裂方式，促使其形成孢子体而非成熟的花粉[15]。Telmer等研究发现，在甘蓝型油菜游离小孢子培养中必须采用高温热激处理，而且 32 ℃ 热激处理小孢子3 d，会使其具有较强的分化能力[16]。本试验中采用32 ℃热激处理1～3 d，获得的愈伤组织数较对照有显著提升，但相比低温预处理效果而言差距很大。可能是因为热激处理虽然可以明显促进小孢子的发育途径的转变，但不同作物处理温度也不尽相同，洋桔梗须要在更高温度或更长时间方面加以尝试。也有可能是洋桔梗对高温反应迟钝，所以热激处理不能引起小孢子理化性质的改变，促使其分化。

在多种作物的游离小孢子培养中，为了提高愈伤组织的发生率，会在适宜范围内向培养基中添加不同的激素种类和浓度。小孢子培养时通常通过添加2，4-D、NAA、IAA等生长素和KT、6-BA、ZT等细胞分裂素来调整小孢子的分裂、分化、愈伤组织的形成等，由于材料的区别，添加的激素种类和浓度各有不同，其最适的激素种类和浓度配比要经过多次试验才能最终获得[17-18]。本试验结果也表明，不同激素组合处理对不同基因型洋桔梗小孢子获得胚性愈伤组织的影响不同，其中以2，4-D的影响最大，浓度取2.0 mg/L；KT次之，浓度为1.0 mg/L；6-BA和NAA较基因型不同，影响的大小顺序稍有差异，但最佳浓度相同，分别是1.0、0.2 mg/L。因此，该试验筛选出的最佳洋桔梗游离小孢子培养诱导胚性愈伤组织的培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+2.0 m/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。

通过本研究摸索出一些提高洋桔梗小孢子诱导胚性愈伤组织的因素，但是影响洋桔梗游离小孢子培养的因素还有很多，如培养方式、供体植株生长条件和生理状况、培养基组分、碳源种类和浓度、活性炭等，每个环节的细微变化都可能会影响出愈率。因此，为了培育出洋桔梗的单倍体植株获得双单倍体即构建DH系还须要进一步研究。

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