辣椒病毒诱导基因沉默接种方法的优化

李然然　王述彬　潘宝贵

摘要：病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，简称VIGS）技术在候选基因功能验证方面起着非常重要的作用。以辣椒八氢番茄红素脱氢酶基因（简称PDS）为目标基因，分析表达载体转化农杆菌的菌液在LB液体培养基和诱导培养基（IM）中D600 nm值的变化趋势。结果表明，当LB液体培养基中菌液D600 nm值为1.15时，后续利用IM培养菌液的效率最高，PDS基因沉默效果明显；优化了农杆菌接种方法，可为辣椒利用VIGS技术进行候选基因的功能验证提供参考。

关键词：辣椒；VIGS；农杆菌接种；基因沉默

中图分类号： Q786文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0082-03

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，简称VIGS）是通过携带靶基因的病毒侵染植株从而引起寄主植株对应的目标基因沉默，使该基因不能继续表达，进而探究基因功能的一种方式[1-2]。目前，VIGS技术已被广泛应用，棉花[3]、烟草[4]、拟南芥[5]、大麦[6]、大豆[7]等植物都已经成功构建了VIGS体系，茄科作物[8-10]也开始普遍利用VIGS技术研究基因功能。候选基因VIGS载体构建成功后，农杆菌接种侵染植株是VIGS的关键步骤，农杆菌菌液培养占据了大量的时间，其中菌液的D600 nm值是试验的关键点。沉默八氢番茄红素脱氢酶基因（简称PDS）可使植株出现明显的白化症状，PDS基因常用作VIGS试验的阳性对照基因[11]。本试验以PDS为目标基因构建VIGS载体接种辣椒，分析在农杆菌振荡培养过程中菌液的D600 nm值，从而简化摇菌的测量次数，为利用VIGS方法进行候选基因功能验证提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试辣椒材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所高效園艺作物遗传改良重点实验室保存的G43（Capsicum annuum L.）。VIGS载体pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV3101菌液引自西北农林科技大学。

1.2试验方法

1.2.1植物材料培养2015年10月，利用RGL-P1000D人工气候箱育苗，出苗前30 ℃、黑暗培养，出苗后，昼、夜温度28、20 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（光照—黑暗为12 h—12 h），湿度60%，培养至2张子叶完全展开、真叶尚未长出时用于接种。

1.2.2试剂配制试剂的配制参照Velásquez等[12]所述，配制体积稍有改动。

20×AB盐配制：NH4Cl 20.00 g、MgSO4·7H2O 6.00 g、KCl 3.00 g、CaCl2 0.20 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，用超纯水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min（若出现沉淀，需要涡旋），备用。

诱导培养基（IM）配制：2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）5.137 g、葡萄糖2.632 g、NaH2PO4 0.164 g，用超纯水定容至500 mL，调节pH值为5.6，121 ℃灭菌20 min，待溶液冷却后加AB盐26.316 mL。IM当天或提前1 d配制，500 mL IM使用前加入500 μL 200 mmol/L乙酰丁香酮、26.316 mL 20×AB盐、500 μL 50 mg/mL卡那霉素、利福平、庆大霉素。

200 mmol/L乙酰丁香酮配制：19.6 mg乙酰丁香酮溶于500 μL二甲基亚砜（DMSO）。

乙磺酸（MES）溶液配制：MgCl2·6H2O 1.016 5 g，MES 1.066 0 g，用超纯水定容至500 mL，调节pH值至5.5，121 ℃灭菌 20 min。

1.3接种方法

参照Velásquez等[12-13]的方法。

1.3.1划板在-80 ℃冰箱中取出pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS转化农杆菌GV3101菌液，冰上融解，分别在三抗LB琼脂板（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L 庆大霉素）上划线，用封口膜封好，标注好名称及日期，置于28 ℃培养36 h左右。

1.3.2挑取单菌落培养准备3个100 mL锥形瓶，分别加入10 mL液体LB培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L庆大霉素），再分别挑取pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS单菌落至锥形瓶中，用封口膜封好，28 ℃、200 r/min 培养。

1.3.3IM摇菌按1 ∶[KG-*3]25的比例混合菌液和IM。pTRV1配制2瓶，pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS各配1瓶，28 ℃、200 r/min 培养27 ～37 h至菌液D600 nm值达到0.5 ～0.8。

1.3.4收集菌体将菌液分别移入50 mL离心管中，4 ℃、3 000 g 离心10 min，移除液体，加入等体积MES重悬，4 ℃、3 000 g 再次离心10 min，收集菌体，用1/2体积的MES重悬。向pTRV1内加入200 mmol/L乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为400 mmol/L，按1 ∶[KG-*3]1将pTRV1分别与pTRV2 ∶[KG-*3]

00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS混合，使乙酰丁香酮终浓度为200 mmol/L，D600 nm值约为0.6，置于22～25 ℃静置3～5 h，用于注射接种。

1.3.5接种幼苗接种前1 d浇水。接种时，在子叶中下部靠近叶脉处用2 mL一次性注射器打孔，用无针头的一次性注射器在子叶背面注射菌液，直至整张子叶充满水渍。注意在注射不同菌液时要更换手套与注射器，避免交叉污染。

1.3.6接种后培养接种后，将幼苗置于人工气候箱中，先18 ℃、黑暗条件培养2 d，再将培养条件调至昼、夜温度22、18 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（16 h—8 h），湿度60%条件下培养。接种后3 d控水以增加发病率。

1.4数据分析

试验设5次重复，采用Eppendorf BioPhotometer plus测量菌液D600 nm值，利用Excel 2007工作薄进行数据整理分析。

2结果与分析

2.1不同LB菌液对IM菌液培养时间的影响

对pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS用LB培养基摇菌后D600 nm为1.00、1.05、1.10、1.15、1.20的菌液进行IM摇菌，用时20～23 h。结果发现，D600 nm值在1.15时进行IM摇菌是效率最高的（表1）。当D600 nm值为1.00时，用IM摇菌达不到D600 nm值为0.5；随着LB培养基D600 nm值的增加，用IM摇菌的效率也逐渐增加，到D600 nm值为1.15时效率达到最高；当D600 nm值为1.20时，用IM摇菌的D600 nm值达到0.5的时间开始增加。

2.2不同菌体LB摇菌随着时间D600 nm值的变化

分别对pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS用LB培养基摇菌，并分别在17、18、19、20 h测量菌液D600 nm值，做3次重复，取平均值，所得结果如图1所示，三者柱状图相似，说明不同菌体之间摇菌时间与对应D600 nm值变化相似。因此，若想探究菌体摇菌时间与对应D600 nm值变化的关系，仅用1种菌体进行试验即可。

2.3LB液体培养基培养菌液

用pTRV1探究菌体摇菌时间与对应D600 nm值变化的关系，挑取5个单菌落（A、B、C、D、E），分别用10 mL液体LB培养基在100 mL锥形瓶中28 ℃、200 r/min振荡培养，所用时间及对应D600 nm值见表2。在摇菌19.0 h时菌液C、D、E的D600 nm值已达到0.90以上，增加测量密度，19.50 h后其D600 nm值达到1.00以上，进一步增加测量密度，结果菌液C、D在19.73 h、菌液E在19.70 h分别达到所需D600 nm值，而菌液A、B在摇菌19.00 h时D600 nm值在0.80左右，可不必增加测量密度。

根据测量结果，菌液在摇菌19.70～20.00 h后达到所需D600 nm值，若想减少测D600 nm的次数，可以在摇菌19.00 h时测D600 nm值，并根据所测值与表2中数据对比，估算再摇菌时间。如D600 nm值达到0.90，预计再摇45 min可达到所需值；D600 nm值达到1.00，预计再摇15 min即可达所需值。

2.4IM菌液培养时间与其浓度的关系

LB培养基摇菌D600 nm值达到1.15左右后，再按菌液 ∶[KG-*3]IM=1 ∶[KG-*3]25 的比例进行混合，做5次重复，分别为菌液1、2、3、4、5，继续摇菌。由表3可以看出，在相同起始D600 nm值下，再进行IM摇菌，所需摇菌时间也有些差异。一般来说，当LB培养基D600 nm值达到1.15，再进行IM摇菌，可在摇菌后27 h测量，再根据所测数据估计摇菌时间。由于IM摇菌所需时间远远多于LB培养基，而且所需D600 nm值范围并不是那么严格，在0.5～0.8 均可，初次测量D600 nm值时间可以稍微晚一点。

由于菌液在不同D600 nm值下的增长速度不同，计算不同菌液在不同时间段的平均值可能与菌液的真正D600 nm值变化有所差异，因此，菌液原始的D600 nm值变化更能说明问题，也更方便做类似试验的研究人员查阅。

2.5MES重悬对菌液浓度的影响

2.6pTRV2 ∶[KG-*3]PDS基因沉默效果

從图2可见，接种pTRV2 ∶[KG-*3]PDS 3周后，辣椒幼苗叶片出现白化症状，其中第1、2张叶片的基部及主脉处明显白化，第3张新生叶片全部白化；接种4周后，幼苗第1、2张叶片的白化范围扩大，第3、4张新生叶片全部白化。接种空载体（pTRV2 ∶[KG-*3]00）幼苗比接种pTRV2 ∶[KG-*3]PDS幼苗的长势稍好，而未接种植株（WT）明显比接种植株长势旺盛。本试验方法能达到PDS基因沉默的目标，可用于后续的基因功能验证。

3结论与讨论

随着VIGS技术的逐渐成熟，不同研究人员采用的农杆菌接种方法有所差异，有的用LB培养基摇过之后就直接用MES重悬[9]，此方法虽然也可以使基因沉默，但是用IM再次摇菌可以提高菌体活性，提高沉默效率。

在进行农杆菌接种试验时，LB培养基摇菌的D600 nm值将影响后期IM摇菌的D600 nm值，本研究得出了最佳的LB培养基摇菌D600 nm值为1.15，而且通过所列举IM摇菌数据可以推算所需摇菌时间，从而合理安排开始摇菌时间，因为IM摇菌时间过长会对菌体活性产生影响，尽量避开摇菌结束时间在晚上，以增加菌体活性，保证最高沉默效率。

Zhang等的试验中仅说明了在LB液体培养液振荡培养时需要24～36 h，IM振荡培养时需20～24 h，本试验探究LB培养基和IM摇菌时间与D600 nm值的关系，得出LB培养基摇菌要在摇菌17 h时测量D600 nm值，IM摇菌要在摇菌后27 h进行测量的结论[13]。所得时间节点与Zhang等稍微有所差别，但根据本试验结果，在Zhang等的试验条件下LB液体培养基浓度可能比较高，难以掌控菌体最佳活性时期。本试验在Zhang等的基础上更加精确了摇菌时间，方便研究人员参考查阅。

采用本研究方法接种，辣椒叶片白化症状明显，说明本试验方案可行，为应用VIGS技术研究辣椒相关基因功能奠定了基础。

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