苏云金芽孢杆菌BJH705菌株cry7Ab基因的克隆及表达

韩超　王丽娟　李海涛

摘要：从海南地区土壤中分离得到1株苏云金芽孢杆菌（Bt）BJH705。经PCR鉴定结果显示，该菌中含有cry7Ab类基因，其晶体形态为双锥形；以全长引物对其进行扩增，得到大小为3 417 bp的片段；通过SDS-PAGE结果显示，此菌株Cry7Ab杀虫晶体蛋白分子量约为130 ku，编码1 139个氨基酸残基，等电点为4.83；序列已提交GenBank注册，登录号为KX010669；对Cry7Ab蛋白的跨膜区域进行分析，得到此蛋白由亲水域和疏水域形成跨膜区，其跨膜区大约由19个疏水氨基酸组成，经Cry7Ab蛋白保守结构域分析含有3个结构域。

关键词：苏云金芽孢杆菌；cry7Ab基因；克隆；表达；杀虫晶体蛋白

中图分类号： Q786文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0085-03

在世界范围内广泛分布着一种革兰氏阳性菌——苏云金芽孢杆菌（Bt），其归类于芽孢杆菌科芽孢杆菌属[1]。它的母细胞会在形成芽孢的同时伴随着形成晶体蛋白，称之为伴胞晶体，伴胞晶体呈现立方体、球形、菱形、镶嵌形、无定形，是具有杀伤活力的杀虫晶体蛋白。

由cry7类基因编码的蛋白的分子量约为130 ku，晶体一般为双锥形。到目前为止，Crickmore（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/）上已经登录了cry7类21种基因，共37个，其中包含9个cry7Ab基因。但是关于cry7类基因的杀虫活性却很少被报道，有研究发现，cry7类基因可以编码对鞘翅目害虫有活性的蛋白；据相关的研究表明，Cry7Ab3蛋白对马铃薯甲虫有较高的杀虫活性[2]。Cry7Ab4蛋白胰蛋白酶（trypsin）酶解液对鞘翅目的大猿叶甲（Colophellus bowringi）显示出一定的杀虫活性，但对鳞翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）、甜菜夜蛾（Spadoptera exigua）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、榆蓝叶甲（Pyrrhalta aenescens）和直翅目的东亚飞蝗（Locusta migraloria manilensis）基本无杀虫活性[3]。Cry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫2龄幼虫具有较高毒力，但对黄粉虫没有杀虫活性，这可能是由于马铃薯瓢虫和黄粉虫的中肠所含的蛋白酶不同[4]。Cry7Ca1蛋白对飞蝗有杀虫活性[5]。由于鞘翅目害虫的危害日益严重，而长期以来我国采用农药的防治方法给环境带来了严重危害[6-9]，因此筛选和鉴定对鞘翅目害虫有活性的基因极为重要。

1材料与方法

1.1材料

液体LB培养基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，pH值为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 min。

固体LB培养基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，1.3%琼脂，pH值为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 min。

Taq DNA聚合酶、KOD酶、pMD19-T 载体、氨苄青霉素、X-Gal、IPTG、DNA marker、蛋白质分子量标准均购自TaKaRa公司；质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；引物由金维智生物工程（北京）有限公司合成；分析纯化学试剂均为市售。

1.2方法

1.2.1土样来源及Bt菌株的分离

土样采自中国海南地区，采用温度法[10]进行Bt菌株的筛选。

1.2.2Bt基因组的提取

分离纯化后的Bt菌株在固体LB培养基上30 ℃过夜培养12 h，采用张彦蕊等的方法[11]提取基因组。

1.2.3cry7Ab基因的鉴定与克隆

根据GenBank上公布的cry7类基因的序列，利用primer 5设计cry7基因的鉴定引物cry7-F/cry7-R及cry7Ab全长的引物cry7Ab-F/cry7Ab-R，序列见表1（金唯智合成）。

利用cry7-F/cry7-R引物对，用Taq DNA聚合酶进行cry7基因的鉴定，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃ 延伸10 min。利用cry7Ab-F/cry7Ab-R引物对，用KOD酶进行cry7Ab全长基因扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 15 s，52 ℃复性30 s，68 ℃延伸 3.5 min，30个循环；68 ℃延伸10 min。将上述PCR产物均用0.7%琼脂糖进行电泳检测，利用ChampGel 6000全自动凝胶成像系统（gel documentation and image analysis system）成像。

按照Axygen公司的胶回收试剂盒说明书进行扩增产物的回收纯化。将回收的PCR产物分别连接pMD19-T克隆载体和pEB表达载体并转入大肠杆菌（Escherichia coli） JM109中，篩选阳性克隆进行PCR验证，以便确认是否连有目的片段。提取连接正确重组细菌的质粒送金维智生物工程（北京）有限公司进行序列测定。

1.2.4cry7Ab基因在大肠杆菌中的表达

提取上述阳性转化子重组质粒转入大肠杆菌BL21中，进行IPTG诱导表达。首先低温离心收集诱导物并弃上清，用20 mmol/L Tris HCl（pH值为8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样用于 SDS-PAGE 分析。大肠杆菌质粒DNA提取、连接、转化方法参照王立光等的方法[12-14]，杀虫晶体蛋白样品制备和SDS-PAGE电泳检测方法参见束长龙等的方法[15-17]，并进行蛋白分析。

1.2.5Cry7Ab蛋白的结构分析

首先通过DNAMAN分析Cry7Ab的氨基酸含量、蛋白的大小、等电点。再利用Expasy的ProtScale程序计算蛋白质的疏水性图谱，运用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMM网站的在线工具TMHMMM分析蛋白的跨膜区。

2结果与分析

2.1菌株分离

将从采集的土样中分离得到的菌株接种于1/2LB固体培养基中，36～48 h进行光学显微镜镜检观察。培养到24 h后，菌落呈乳白色，46 h后晶体完全裂解。从图1中可以看出，这个菌株的晶体形态为双锥形（箭头所指）。

2.2苏云金芽孢杆菌cry7Ab基因的克隆

以实验室保存菌株提取的基因组为模板，以引物对cry7-F/cry7-R 进行PCR鉴定，得到大小1 500 bp左右的片段（图2）。以全长引物cry7Ab-F/cry7Ab-R对其进行扩增，通过测序得到3 417 bp的片段（图3），与经报道过已知的cry7Ab基因的碱基相似度为98.30%，与已知Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度为99.91%。

2.3Cry7蛋白的表达和结构分析

2.3.1Cry7Ab蛋白在大肠杆菌中的表达

将引物对 cry7Ab-F/cry7Ab-R扩增产物回收、連接pEB表达载体，转化到JM109感受态细胞后经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆命名为705-Cry7Ab，并进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果见图4。cry7Ab基因在大肠杆菌中诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果表明，该基因编码130 ku左右的杀虫晶体蛋白Cry7Ab，与推测的蛋白大小一致。

2.4氨基酸序列分析

用ExpasyProtParam工具预测cry7Ab编码1 139个氨基酸残基，表达的蛋白质大小约为130 ku，与已知的Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度为99.91%。等电点pI为4.83，与预测结果相符。其中，Ala、Glu、Leu、Arg、Ser氨基酸含量最多，Asp、Phe、Lys、Gln、Trp这5种氨基酸含量为0。

2.5Cry7Ab蛋白的跨膜区域分析

利用expasy站点的氨基酸序列亲水性和疏水性分析功能对Cry7Ab蛋白进行研究。Expasy的ProtScale程序计算蛋白质的疏水性，见图5。1 000位点以前为主要的疏水区和亲水交替区域，说明该区域的氨基酸可能为跨膜区域，可能形成了α螺旋束。再运用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMM网站的在线工具TMHMMM分析蛋白的跨膜区[18-20]，Cry7Ab蛋白的跨膜区分析结果如图6所示，其跨膜区大约由19个疏水氨基酸组成。

2.7Cry7Ab蛋白保守结构域分析

[JP+1]通过NCBI Conserved Domain分析结果表明，δ-内毒素的C-末端结构域可能与碳水化合物结合功能相关，δ-内毒素的C-末端结构域是δ-内毒素活性区的一部分，这是由芽孢杆菌杀虫毒素的细菌芽孢在形成过程中产生的。活化的内毒素与中肠上皮细胞结合，导致细胞裂解死亡。此激[CM（25]活区域的δ-内毒素由3个结构域组成，N-末端的螺旋结构域（Ⅰ）涉及膜插入和孔的形成，而第2、3个结构域（Ⅱ、Ⅲ）参与受体结合，结构域Ⅲ的结构类似于碳水化合物结合结构域。

3结论与讨论

已知的cry7Ab3对马铃薯甲虫有杀虫活性，其中cry7Aa杀马铃薯甲虫（LC50为13.1 μg/mL）[17]，cry7Ba1杀小菜蛾（3 d LC50为0.095 7 μg/ mL，5 d LC50为0.039 9 μg/mL）[18]，cry7Ca1对飞蝗有杀虫活性（48 h LC50为4.73 μg/mL，72 h LC50为3.19 μg/mL）[19]，cry7Ab8对马铃薯瓢虫2龄幼虫具有较强的杀虫活性，Cry7Ab4胰蛋白酶酶解液对鞘翅目害虫的大猿叶甲有一定的杀虫活性，其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59、293.79 μg/mL。

本研究以笔者所在实验室从海南地区不同地点采集的土样中分离得到的96株Bt野生菌为材料，经统计分析得出Bt的分布可能与土样采集的密集程度、植被覆盖种类等原因相关，并对这96株Bt菌株进行cry7Ab基因的鉴定。其中，从编号为BJH705菌株中成功克隆得到1株晶体形态为双锥形的含有cry7Ab全长基因的菌株，片段大小为3 417 bp，克隆得到的cry7Ab基因与已知的cry7Ab3基因相似性为98.30%。序列已提交GenBank注册，登录号为KX010669。成功构建表达载体后，在大肠杆菌BL21中表达了130 ku左右大小的新型杀虫蛋白，与预测结果大小相符，与已知的Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度为99.91%，其中Asp、Phe、Lys、Gln、Trp这5种氨基酸的的含量为0，可能与Cry7Ab蛋白的活性相关。对Cry7Ab蛋白的跨膜区域进行分析，发现亲水域与疏水域是相互交替的，大约由19个疏水氨基酸组成跨膜区。分析Cry7Ab蛋白保守结构域发现含有3个结构域，由此可以对此基因的结构及功能有进一步的了解[20-21]。

因此，本研究克隆得到的cry7Ab基因编码的蛋白也许会对鞘翅目害虫有较高的杀虫活性，可以为Bt基础研究及转基因植物、Bt工程菌的构建提供新材料，为Bt新型基因的发掘及扩大杀虫谱奠定基础[22]。

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