霍山不同海拔香茶菜居群的遗传多样性

张晓舟　王祎玲

摘要：采用表型性状和序列相关扩增多态性（简称SRAP）分子标记对香茶菜（Isodon japonica）不同海拔居群的遗传多样性进行分析。结果表明：（1）香茶菜8个叶表型性状在居群间和居群内均存在显著或极显著差异，说明不同居群叶表型性状存在明显的变异；（2）香茶菜叶柄性状的平均变异系数（CV，19.707%）>叶片性状的平均变异系数（CV，9.905%），叶柄性状稳定性较低；（3）居群间平均表型分化系数（VST，69.89%）>居群内平均表型分化系数（VST，30.11%），居群间变异是其主要的变异来源；（4）非加权组平均法（简称UPGMA）聚类分析显示，8个香茶菜居群分为三大类；（5）香茶菜居群具有较高的遗传多样性，平均多态位点数（NPL）、平均多态位点百分率（PPB）、平均Shannon多样性指数（I）分别为60.875、82.083%、0.387；（6）8个居群遗传多样性变化规律随海拔的升高先增加后降低；（7）分子生物学方差分析（简称AMOVA）显示，居群间遗传变异占总变异的75%，与表型性状分析的主要变异来源一致；（8）聚类分析将8个居群分为3类，海拔相近的居群优先聚类。

关键词：香茶菜；表型性状；SRAP；遗传多样性；霍山

中图分类号： S567.03文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0107-05

霍山位于山西省南部，是传说中太岳山的主要高峰，位于太行山中部，属于临汾盆地的边缘区域[1]。由于受暖温带大陆性气候和东南季风的影响严重，成为山西省乃至全国水热条件相对较好的区域之一。

香茶菜（Isodon japonica）为唇形科（Labiatae）香茶菜属（Isodon）植物，主要生长在非洲和亚洲，有150多种，在我国有90多种，山西、黑龙江、河南等20多个省内都比较常见[2]。香茶菜是中国药材，它具有健胃、解毒、抗癌、增加免疫等功效，被用于治疗咽喉肿痛、肝炎、癌症、感冒发热、腹部胀痛等[3]。从开始研究香茶菜至今，很多研究者从香茶菜的提取产物中提炼出有用的化合物，并深入地分析了其药理作用，很多文献报道以及临床等实践证明香茶菜在保护心肌正常工作等方面具有非常重要的作用，同时香茶菜在保健防护方面市场潜力非常大[4-5]。由此可见，香茶菜已成为中国最重要的草本之一。然而，香茶菜遗传多样性方面的研究却很少，甚至没有关于香茶菜表型的研究。

为确保我国合理发展和最大限度地使用遗传资源，有必要研究香茶菜的遗传多样性。另外，香茶菜种质收集的遗传多样性和对群体结构的了解在改善中国草本植物上有非常重要的功能。近年来，分子标记技术日益发展，为野生植物遗传多样性研究提供了很多重要信息。在不同的分子标记中，SRAP分子标记对遗传研究是最佳选择，因为它在植物基因组中具有简单、高效、高重复性、共显性的特征。目前，关于香茶菜的研究主要集中在化合物组成、药理效果上。本研究的目标是运用表型标记和SRAP分子标记阐述香茶菜的遗传多样性。

因此，在本研究中，使用10对香茶菜SRAP引物和8个表型性状决定山西省霍山不同海拔香茶菜的遗傳多样性。

1材料与方法

1.1植物材料采集

2015年6月外出采集，选取山西省霍山不同海拔的香茶菜为研究对象，从1 300 m至2 000 m每隔100 m设立1个种群，共设立8个居群。为避免试验误差，每个居群内至少采集15个个体的叶片，保存在放有硅胶的密封袋中，以便后续实验室内的研究[6]。

1.2叶表型性状分析

评价8个居群香茶菜的表型多样性，每个居群选取采样完整、保存最好的15个个体进行测量。在本试验中测量8个表型性状，分别是叶长（LL）、叶片长（LML）、叶片宽（LW）、叶片长/宽（LLW）、叶柄长（LSL）、叶柄基部宽（LFW）、叶柄长/宽（LSLW）、叶片长/叶柄长（LLL）。

1.3DNA提取物

采用改良的CTAB法[7]提取DNA，在提取过程中，利用β-巯基乙醇的还原性，有效地遏制DNA提取过程对细胞造成的褐化反应，大大降低了氧化损伤。抽提过程中，利用氯仿异戊醇除去蛋白质。加入-20 ℃无水乙醇，静置一段时间，待沉淀析出，即得到DNA提取物。采用1%琼脂糖电泳检测DNA提取物中DNA的纯度。

1.4SRAP分析与电泳

SRAP扩增在10 μL体系中进行，使用10 ng基因组DNA、1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/L dNTPs、5 μmol/L引物、1.0 U Taq DNA聚合酶。所用引物由博仕生物公司提供。

PCR扩增项目的变性步骤为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共进行35个循环；72 ℃延伸5 min，保存于4 ℃。扩增片段被20倍的水稀释，6 μL稀释产物与4 μL Loading-buffer混合。扩增产物在1×TBE的6%变性甲叉双丙烯酰胺凝胶中被检测，1 500 V电泳120 min。通过使用银染装备使分离片段形象化。

1.5数据分析

1.5.1表型数据分析

上述8个表型性状的巢式方差分析采用SPSS 17.0软件完成[8]。种群间表型性状的分化程度用表型分化系数（VST）表示[9]，表型分化系数=种群间方差分量/（种群间方差分量+种群内方差分量）。表型性状的离散程度用变异系数（CV）表示，变异系数=标准差/平均值，即CV=S/X。采用NTSYSpc软件的非加权组平均法（UPGMA）对表型性状进行聚类分析。其他相关数据处理使用Excel 5.0等程序进行。

1.5.2遗传数据分析

在筛选引物的过程中，选取稳定性高、扩增条带清晰、易于分辨的引物组合。对SRAP引物扩增出的片段进行“0，1”标记，将有带处记为“1”，无带处记为“0”。利用POPGENE 3.2版本软件[10]，通过分析香茶菜的多态位点比率（PPB）、观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon多样性指数（I）、Neis基因多样性指数（H），多态位点数（NPL）来证实香茶菜遗传多样性水平的遗传参数[11]。应用MEGA4软件[12]对香茶菜不同海拔的8个居群进行聚类分析。用GenALEx 6.4软件[11]进行分子生物学方差（简称AMOVA）分析和各居群间的主坐标（简称PCoA）分析。

2结果与分析

2.1叶性状表型多样性

2.1.1香茶菜居群间和居群内表型性状变异特征

山西省霍山8个不同海拔香茶菜的表型性状测量结果（表2）显示，叶柄长与叶柄基部宽均以2 000 m居群的均值最大（分别为50.47、3.66 mm）；1 300 m居群的均值最小（分别为29.61、2.95 mm）。叶长、叶片长、叶片宽均以1 400 m居群的平均值最大（分别为199.99、153.03、140.94 mm），叶片长、叶片长/宽均以1 600 m居群的平均值最小。随着海拔的降低，基本呈现出叶片的性状数值越大，叶柄性状的数值越小。

本研究用变异系数的大小表示各性状测量值离散程度的大小。变异系数越小，说明性状的离散程度越小，表型多样性的丰富程度越低；反之，说明性状的离散程度越大，表型多样性的丰富程度越高。由表3可知，香茶菜居群中各表型性状的平均变异系数为16.207%，其中叶柄基部宽的平均变异系数最小（8.030%），叶片长/叶柄长的平均变异系数最大（30913%）。8个叶表型性状的平均变异系数都较为稳定，可应用于表型多样性的相关研究中。

不同性状在同一居群的变异系数也存在差异，1 600 m海拔的居群中叶片长/叶柄长最大（42.338%），叶片长/宽最小（10.449%），同一性状在不同居群内的变异系数也存在不同，叶柄长/宽在1 300 m最小（16.959%），在 2 000 m 最大（46.338%）；叶片长/叶柄长在1 300 m最小（18.883%），在2 000 m最大（53.829%），表明不同海拔的环境差异引起叶表型性状的差异。

香茶菜8个海拔居群的平均变异系数存在差异，由小到大排列为1 400 m（11.569%）<1 900 m（11.670%）<1 300 m（12.062%）<1 800 m（13.113%）<1 500 m（14272%）<1 700 m（18.453%）<1 600 m（21.429%）<2 000 m（27.089%），海拔1 400 m居群的叶表型分化程度最小，说明其表型多样性也最低；海拔2 000 m居群的平均变异系数最大，分化程度最高，遗传多样性最丰富。

从对8个表型性状的方差分析结果（表4）可以看出，山西省霍山香茶菜8个叶表型性状在居群间存在极显著差异，在居群内除叶柄基部宽存在显著差异外，其余性状均差异不显著，说明同一居群内存在相对稳定性。香茶菜平均表型分化系数为69.89%、居群间的平均方差分量为58.34%，居群内的平均方差分量为21.54%，表明叶表型性状多样性呈现出居群间大于居群内的特征，山西省霍山8个海拔叶表型性状变异以居群间变异为主。山西省霍山香茶菜8个居群叶表

型性状指数主要受居群间环境条件和海拔高度不同的影响较大。通过表4同时可以看出，叶片宽、叶片长/宽的表型分化系数较大，分别为85.23%、83.33%。说明这2个性状的变异在居群间占优势。

2.1.2表型性状聚类分析

根据欧式平均距离，对香茶菜8个海拔的8个叶表型性状数据进行UPGMA聚类分析（图1）。由图1可知，在遗传距离系数为0.05时出现分界线，8个居群被分为三大类。其中1 700、1 800 m海拔处的居群叶表型特征基本一致，聚为一类；1 900、2 000 m居群的叶表型性状较为相似，聚为一类；1 300、1 400、1 500、1 600 m居群距离相近，聚为一类。整体上看，8个不同海拔居群叶表型性状特征依海拔高度而聚类。

2.2叶的遗传多样性

2.2.1SRAP遗传多样性

8个海拔香茶菜居群的遗传变异参数总结在表5中，NPL、PPB、Na、H、I值在海拔1 400 m居群有最大值（NPL=72.000、PPB=90.000%、Na=1.900±0302、H=0.333±0.168、I=0.492±0.224），在海拔1 800 m居群有最小值（NPL=46.000、PPB=57.500%、Na=1.575±0.498、H=0.224±0.208、I=0.329±0.299）。Ne值的最高值在海拔 1 300 m 居群（1.586±0.370），最低值在海拔 2 000 m 居群（1.385±0.371），平均值为1.444。

依据SRAP数据分析和比较香茶菜居群间和居群内的遗传多样性。AMOVA结果（表6）显示，75%的遗传多样性来自居群间，25%的遗传多样性来自居群内，香茶菜的遗传变异主要来自于居群间。AMOVA分析在居群间和居群内存在极显著或显著差异。

2.2.2居群的遗传距离与聚类分析

利用POPGEN软件进一步分析香茶菜居群间遗传分化程度，结果（表7）表明，遗传距离为0.037 5～0.221 2，遗传的一致度为0.801 5～0.963 2。在海拔1 900、2 000 m的居群均与海拔1 300 m居群间有最大遗传距离和最小遗传相似度，該最大遗传距离为0.221 2，最小遗传相似度为0.801 5，呈现出较大的遗传差异。

建立基于Nei遗传距离的UPGMA聚类分析测量8个种基因观察数；Ne为有效等位基因；H为Neis多样性指数；I为Shannon多样性指数。

3结论与讨论

在植物适应进化的过程中，自然选择作为推动力，引起了表型的分化，植物表型性状的变异对促使植物适应当地生存环境具有重要意义[13]。表型性状由基因与生态环境共同决定，而表型性状的多样性必然蕴含着基因组成的多样性[14]。本研究通过对山西省霍山不同海拔香茶菜居群叶表型性状的研究发现，8个叶表型性状在居群间和居群内均存在极显著或显著差异。除了海拔1 300 m受人类活动影响较大外，在海拔1 400～2 000 m范围内，叶长、叶片长、叶片宽这3个性状的均值随海拔的升高而递减；叶柄长、叶柄基部宽的均值随海拔的升高而增大。

香茶菜叶片8个表型性状平均变异系数为16.207%，变异幅度为8.030%～30.913%，叶柄性状的平均变异系数（19.707%）>叶片性状的平均变异系数（9.905%），表明香茶菜居群內表型性状离散程度较高，且叶片性状是叶表型性状中较为稳定的遗传特征。8个海拔中2 000 m香茶菜叶表型性状变异系数均值最大，为27.089%，说明海拔2 000 m可能是山西省霍山香茶菜表型多样性的中心。

香茶菜8个表型性状的平均表型分化系数水平偏高（69.89%），高于苦楝（54.47%）[15]、白云杉（50.00%）[16]、紫丁香（43.93%）[17]、疏花蔷薇（41.84%）[18]，说明该居群间存在较大的变异，反映了居群基因与环境间相互作用的复杂性，是不同环境选择的结果，是种群分化的源泉[19-21]。香茶菜居群内平均表型分化系数偏低，为30.11%，说明香茶菜的主要变异来源是居群间的变异，该变异主要受到居群间环境差异的影响。

香茶菜8个居群依据叶表型性状建立的系统发育树在遗传距离系数0.05处分为三大支。1 300～1 600 m聚为一支；1 700、1 800 m聚为一支；1 900、2 000 m聚为一支。结果表明，叶表型性状的特征与地理距离特征相吻合。

不同海拔香茶菜8个居群的SRAP标记研究显示（表6），在海拔1 400 m居群出现最大的多态位点数（72.000）、最高的多态位点百分比（90.000%）、最高的Shannon多样性指数（0.492±0.224），具有较高的遗传多样性。随着海拔降低到1 400 m，其遗传变异水平有所下降（NPL=68.000、PPB=85.000%、I=0.481±0.246）；海拔升高到1 800 m，其遗传变异水平进一步下降（NPL=46.000，PPB=57.500%，I=0.329±0.299）。由此可知，香茶菜遗传变异水平的高低与海拔有关，整体表现为随着海拔的升高，香茶菜遗传多样性呈现出先升高后降低的规律。野外调查发现，低海拔居群受到人为活动和牲畜啃食的影响较大，极易发生遗传漂变，从而使其遗传多样性降低。当海拔继续上升时，温度随之下降，影响香茶菜的生长发育，最终导致居群内个体数量减少，遗传多样性降低。

海拔分布与居群的遗传关系之间有非常重要的意义。AMOVA分析显示，香茶菜遗传多样性主要存在于居群间，因此居群间存在较高的基因流和遗传分化（表7）。聚类分析中，海拔1 300 m单独聚为一类，海拔1 400、1 500、1 600 m聚为一类，海拔1 700、1 800、1 900、2 000 m聚为一类，香茶菜居群间遗传距离与地理距离之间有明显的相关性。另外，统计学研究表明，影响居群水平上遗传多样性大小的因素是繁殖系统>分布范围>生活方式>分类地位>种子传播方式[22]。

8个海拔香茶菜叶表型性状的多样性和SRAP标记的遗传多样性均主要表现为居群间的遗传变异，二者具有一致性。聚类分析中聚为三大类，均表现出海拔相近的居群优先聚类，但各居群在每一大类中的聚集情况又有所不同。再次表明，表型的变异主要来源于基因组的变异，同时又受到生存环境的影响。

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