饲料复合微生物发酵菌种比例的筛选研究

王小明，杨在宾*，刘晓明，李兆勇，李祥明

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.北京科为博生物科技有限公司，北京 100193；3.山东省饲料质量检验所，山东 济南 250022）

饲料复合微生物发酵菌种比例的筛选研究

王小明1，杨在宾1*，刘晓明1，李兆勇2，李祥明3

（1.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018；2.北京科为博生物科技有限公司，北京 100193；3.山东省饲料质量检验所，山东 济南 250022）

本文旨在研究乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌复合发酵对饲料pH、干物质回收率（DMR）和还原糖含量的影响，探讨菌种的适宜添加比例。以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌的不同添加比例为因素（每个因素3个水平），设计9组发酵模型，35～37 ℃固态发酵，每12 h检测一次pH，取发酵0 h、24 h、48 h和72 h样品进行还原糖含量和DMR的检测。结果表明：在相同时间内，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌添加比例为2∶2∶2或2∶2∶3，饲料pH较低，发酵进程较快（P＜0.05）；添加比例为2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，饲料发酵后还原糖的含量显著提高（P＜0.05）；发酵72 h，各处理之间饲料DMR差异不显著（P＞0.05），饲料干物质损失平均为6.15%。本试验条件下，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌复合发酵的适宜添加比例为2∶2∶2。

复合微生物发酵；pH；还原糖；干物质回收率

微生物发酵产生的大量有机酸和消化酶，能够抑制或杀死有害菌，维持动物肠道菌群的生态平衡，促进肠道健康和饲料消化，提高动物的生产性能[1-2]。研究报道，枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌组合发酵豆粕，能够提高豆粕的氨基酸含量[3]；植物乳酸杆菌、芽胞杆菌和酵母菌复合发酵能够改善饲料营养成分，提高饲料营养消化率[4]。微生物群落的生物多样性，可以影响发酵系统的功能，且发酵基质中各菌群彼此间相互依存、共同作用[5]。复合益生菌发酵不仅能够提高饲料消化率，而且由于益生菌大量繁殖，使发酵饲料兼有益生菌添加剂的特点[6]。目前的研究重点主要集中在微生物发酵单一原料及发酵后营养物质的变化分析，对于应用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌复合发酵配合饲料及研究其添加比例的报道较少，且大部分试验研究参数是基于实验室条件，与实际生产需求存在一定差距。因此，本试验模拟实际生产条件，通过研究微生物复合发酵对饲料pH、还原糖含量和干物质回收率的影响，探讨乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌复合发酵的适宜添加比例，为发酵饲料的科学生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发酵菌种：乳酸菌（Lactobacillus），5×109CFU/g； 酵 母 菌（Yeast），4.6×109CFU/g；枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis），1.9×1010CFU/g；北京科为博生物科技有限公司提供。

发酵基质：玉米-豆粕型基础日粮，日粮配方设计参照NRC（1998）生长猪标准配制，日粮配方组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础，%）

表2 试验设计

表3 复合微生物发酵饲料pH的变化规律

1.2 试验设计

以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌的添加比例为3个因素，每个因素3个水平，设计9组发酵模型（表2）。

1.3 试验方法

将发酵菌种与发酵基质混合，加水调节至水分含量为45%，搅拌均匀，装入塑料桶（20 kg），密封发酵，发酵温度控制在30～35 ℃。每个处理8个重复，0 h开始，每12 h取样检测pH（每个重复3个平行），连续测定8次。取发酵0 h、24 h、48 h和72 h样品，进行还原糖含量和干物质回收率（dry matter recovery，DMR） 的测定。

1.4 样品检测

1）pH：根据AACC（2000）的方法[7]，称取10 g发酵样品，放入三角瓶中，加入90 mL蒸馏水。用磁力搅拌器搅拌30 min，静置10 min后用pH计测定。重复3次取平均值。

2）还原糖（reducing sugar）含量：采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定[8]。

3）干物质回收率（dry matter recovery，DMR）：按饲料发酵前后重量和干物质（DM）含量计算[9]。

1.5 数据处理

数据处理采用SAS 9.2的ANOVA进行方差分析，Duncan 氏进行多重比较；采用Origin 9.1进行二次线性拟合（f(x)=ax2+bx+c），a为二次项系数，b为一次项系数，c为常数项。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲料pH的变化

各组饲料pH的变化规律见表3、表4。从表中可以看出：不同处理组的饲料pH逐渐降低，随着发酵的进行降低逐渐减缓，且均呈现二次曲线规律（P＜0.001）。饲料pH拟合方程的二次项系数a和一次项系数b，各处理之间差异极显著（P＜0.01）；常数项c值，各组之间差异不显著（P＞0.05）。其中，A2和A5组a值略高于其他组，但二者之间差异不显著（P＞0.05）。从发酵开始到饲料pH基本稳定，拟合方程的二次项系数a值越大，降低相同pH所需的时间越短。由以上分析可知，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌的添加比例为2∶2∶2或2∶2∶3，在相同时间内，饲料pH较低，发酵进程较快。

表4 复合微生物发酵饲料pH拟合曲线变化规律

表5 复合微生物发酵饲料还原糖含量的分析 %

表6 复合微生物发酵饲料干物质回收率的分析 %

2.2 饲料还原糖含量的变化

饲料还原糖含量的测定结果见表5。由表5可知：在发酵过程中添加不同比例的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌，能够显著提高发酵后饲料的还原糖含量（P＜0.05），随着发酵的进行还原糖含量的增加减缓。其中，A2组、A3组和A5组相比较，饲料还原糖含量差异不显著（P＞0.05），但显著高于其他处理组（P＜0.05）。由此可知，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌的添加比例为2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，均能够明显提高饲料发酵后还原糖的含量。

2.3 饲料DMR的变化

乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌复合发酵，饲料DMR的比较分析见表6。从表中可以看出：饲料经过微生物发酵后，具有一定程度的干物质损失，随着发酵时间的延长干物质损失增加缓慢。其中，饲料发酵24 h，各组间的饲料DMR无显著差异（P＜0.05）；发酵48 h，A9组饲料DMR显著低于其他组（P＜0.05）；发酵72 h各组的饲料DMR彼此之间差异不显著（P＞0.05），干物质的损失量平均为6.15%。

3 讨论

3.1 复合微生物发酵对饲料pH的影响

发酵过程中酸含量的增加有利于饲料的长期保存，且饲料pH的降低与酸含量的增加有直接关系[5，10]，因此pH能够反映饲料发酵后的酸含量水平。乳酸菌在发酵过程中能够利用碳水化合物等营养物质，产生乳酸、醋酸等有机酸，降低底物的pH[10]。Alvarez-Martin等[11]通过混合培养研究酵母菌和乳酸菌的生长活动及其相互作用，发现酵母菌和乳酸菌混合发酵可以调控代谢产物的变化，酵母菌能够通过与乳酸菌的共生作用刺激乳酸菌活动，从而促进乳酸的产生及pH的降低。枯草芽孢杆菌能够代谢产生乳酸等有机酸，同时消耗环境中的游离氧，创造厌氧条件，促进乳酸菌的大量繁殖并产生乳酸，降低pH[12]。本试验研究结果表明，添加乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌后，随着发酵时间的增加，饲料pH逐渐降低，并呈二次曲线的规律。其中，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌的添加比例为2∶2∶2或2∶2∶3时，饲料的pH降低速度最快，发酵进程最快。从而推测乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌按照一定的比例组合混合发酵，能够充分利用彼此间的协同性、互补性，发挥组合正效应，促进乳酸等有机酸的产生，降低饲料pH。随着发酵时间的延长，pH下降缓慢，维持在一定水平。这可能是随着pH的降低，发酵产生的有机酸积累到一定程度，优势菌群（乳酸菌等）的生存受到的酸抑制作用增强，活性逐渐减弱，从而造成产酸能力下降。

3.2 复合微生物发酵对饲料还原糖的影响

微生物在生长过程中产生的酶可以降解饲料中的营养物质，部分与氨基酸结合的还原糖得到释放，从而提高碳水化合物的利用率。枯草芽孢杆菌在发酵过程中产生纤维素酶，降解发酵基质中的纤维素，提高还原糖含量。微生物发酵产生的淀粉酶可以有效降解淀粉为单糖，提高还原糖的含量[13]。闫亚婷等[14]利用枯草芽孢杆菌发酵玉米粉，发现与对照组相比玉米粉的中性洗涤纤维下降了4.67%，酸性洗涤纤维下降了41.63%，发酵产物中还原糖质量分数提高了2.1倍。Chumchuere[15]等、Wang[16]等 人 研究报道，随着发酵时间的延长，豆粕中葡萄糖、果糖和半乳糖等还原糖的含量会增加趋缓。本研究结果表明，饲料经微生物发酵后，还原糖的含量显著提高，且乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌的添加比例为2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3，饲料的还原糖含量最高。按一定比例组合的乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌，随着发酵进行，温度升高，pH下降，产酸增加，酶促反应加快，促进纤维素和淀粉的降解，进一步提高单糖等还原糖的含量，提高饲料的利用率。随着时间的延长，饲料还原糖的增加趋缓，最终维持稳定。可能的原因是随着饲料pH的降低，枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活性受到抑制，分泌的酶类减少，同时纤维素酶和淀粉酶等的降解能力受到抑制。

3.3 复合微生物发酵对饲料DMR的影响

干物质损失是指微生物消耗发酵基质的营养物质用于维持自身的生长繁殖，部分能量在转化过程中以热能的形式散失[13]。DMR表示发酵过程中养分的损失程度，其数值越高，说明发酵损失越小，营养物质的降解越少。本研究中，发酵72 h，各处理组间的饲料DMR并无显著差异，但平均干物质的损失量在6.15%。这与丁雪等[17]的研究结果基本相符，随着时间的延长，干物质损失持续增加，最大的干物质损失为19.73%。

4 结论

在本试验条件下，复合微生物能够有效加快发酵进程，提高饲料还原糖含量，发挥出组合正效应。相同时间内，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌添加比例为2∶2∶2或2∶2∶3，饲料pH最低，发酵进程最快；添加比例为2∶2∶2、2∶2∶3或3∶3∶3时，能够显著提高饲料发酵后的还原糖含量；发酵72 h后，饲料的干物质回收率差异并不明显，干物质损失量平均在6.15%。

综上所述，在本试验条件下，乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌复合发酵饲料的适宜添加比例为2∶2∶2。

[1] CHAUCHEYRAS-DURAND F，DURAND H. Probiotics in animal nutrition and health[J]. Beneficial Microbes， 2009， 1(1)： 3-9.

[2] OLSTORPE M， LYBERG K，LINDBERG J E， et al. Population diversity of yeasts and lactic acid bacteria in pig feed fermented with whey， wet wheat distillers' grains，or water at different temperatures[J]. Applied and environmental microbiology， 2008， 74(6)： 1696-1703.

[3] 李文立，孙振钧，任慧英.组合微生物发酵提高豆粕品质的方法与优化工艺研究[J]. 中国粮油学报 ， 2013，28(1)：88-92.

[4] 魏金涛，赵娜，杨雪海，等.发酵饲料对断奶仔猪生产性能，血液生化指标和饲料养分表观消化率的影响[J].中国粮油学报 ，2009， 24(2)： 129-133.

[5] VIJAYALAKSHMI S P， RAICHUR A M.The utility of Bacillus subtilis as a bioflocculant for fine coal[J].Colloids and Surfaces B： Biointerfaces， 2003， 29(4)： 265-275.

[6] 刘瑞丽，李龙，陈小莲，等.复合益生菌发酵饲料对肥育猪消化与生产性能的影响[J].上海农业学报 ，2011，27(3)：121-125.

[7] AACC，Hydrogen-Ion Activity(pH)—Electrometric Method[S] St.Paul， MN： The Association， 2000 ：02-52.01.

[8] 赵凯，许鹏举，谷广烨.3， 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究[J].食品科学，2008，29(8)：534-536.

[9] 李龙，陈小连，徐建雄.复合益生菌发酵饲料工艺参数及品质研究[J].上海交通大学学报：农业科学版 ，2010，28(6)：530-533.

[10] 张国华，何国庆.传统发酵食品中乳酸菌多样性及其功能特性[J].中国食品学报 ，2013，13 (9)：174-181.

[11] ALVAREZ-MARTIN P， FLOREZ A B， HERN NDEZ-BARRANCO A，et al.Interaction between dairy yeasts and lactic acid bacteria strains during milk fermentation [J]. Food Control，2008， 19(1)： 62-70.

[12] 胡新旭，周映华，刘惠知，等.无抗发酵饲料对断奶仔猪生长性能，肠道菌群，血液生化指标和免疫性能的影响 [J]. 动 物 营 养 学 报 ，2013，25(12)：2989-2997.

[13] 韩建荣，赵文婧，高宇英.灵芝固态发酵降解玉米淀粉的初步研究[J].食品与发酵工业，2004，30(7)：59-61.

[14] 闫亚婷，周安国，王之盛.枯草芽孢杆菌固态发酵玉米粉的研究[J].中国粮油学报，2011，26(1)：52-55.

[15] Chumchuere S， Robinson R K.Selection of starter cultures forthe fermentation of soya milk[J]. Food Microbiology，1999， 16(2)： 129-137.

[16] WANG Y C， YU R C， YANG H Y， et al. Sugar and acid contents in soymilk fermented with lactic acid bacteria alone or simultaneously with bifidobacteria[J].Food Microbiology，2003，20(3)：333-338.

[17] 丁雪，马晓燕，张先舟，等.降解游离棉酚的热带假丝酵母菌的发酵动力学研究 [J]. 中国酿造，2011，30(6)：131-134.

2017-07-05）

山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队建设项目SDAIT-08-04

* 通讯作者：杨在宾（1961-），男，教授，博士生导师，研究方向：动物营养与饲料科学，E-mail：yzb204@163.com