龙胆愈伤组织中叶绿素的含量测定*

程玉鹏，马爱萍，王洪月，宁 愿，李天聪，李弘琨

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨150025）

龙胆愈伤组织中叶绿素的含量测定*

程玉鹏1,2，马爱萍1，王洪月1，宁 愿1，李天聪1，李弘琨1

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.哈尔滨师范大学，黑龙江 哈尔滨150025）

为了提高龙胆愈伤组织中叶绿素的提取率，现采用分光光度法测定不同提取液对其影响。结果表明，随着提取液组分的不同，叶绿素吸收光谱极其相似，其含量和稳定性却有显著变化。当溶剂中水量减少时，叶绿素的提取速率及叶绿素提取液的稳定性显著升高。在3种提取液中，叶绿素a的稳定性不如叶绿素b。丙酮；无水乙醇为2∶1的无水混合液为较佳的提取液，可用于大批量样品中叶绿素的提取测定。

龙胆愈伤组织；叶绿素；含量测定

龙胆（Gentianae Radix et Rhizoma）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）植物[1]。近年来对龙胆的研究主要集中在药用价值及临床应用等方面[2]，而龙胆组织培养方面的报道颇少，更未见其组培体系中叶绿素含量测定的相关论著。叶绿素不但是植物叶片的主要光合色素，也是植物生理研究中的重要指标[3]，在龙胆愈伤组织中，叶绿素也同样具有不可替代的作用。因此，本文着重研究龙胆愈伤组织中叶绿素含量变化。

测定叶绿素含量的方法主要有传统的分光光度法和活体叶绿素仪法，之后又有人采用光声光谱法。其中，应用最为广泛的是分光光度法[4]。但由于所用的提取叶绿素的溶剂不同，又有许多种测定方法，用的较普遍的是Arnon法。由于该法提取麻烦，提取速度慢，工作量大，叶绿素易受光氧化，测定值偏低等原因，不适合大批量样品的测定[5]。本试验在前人的研究基础上，以Arnon法作对照，采用丙酮与乙醇的混合液作为提取液，提出了提取液中含水量对叶绿素含量测定有显著的影响这一见解，解释了常规的Arnon法测定值偏低的根本原因。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

DHP-9160电热恒温培养箱（山东博科生物产业有限公司）；UV BlueStar A（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）；AE240电子分析天平（Mettler Toledo）；具塞刻度试管（50m L），漏斗，滴管，滤纸，试管架。

龙胆愈伤组织（哈尔滨师范大学王臣老师友情赠送的种子萌发诱导而得）。

1.2 测定方法

1.2.1 提取液的配置 用丙酮、无水乙醇和蒸馏水分别按 12∶6∶0，12∶6∶2，12∶0∶3 的比例配成A，B，C 3种混合提取液。

1.2.2 叶绿素的浸提 分别于试管中加入20m L提取液。把愈伤组织切成1mm小块，混匀。分别准确称取3.0g放入盛有提取液的试管中，用塞封口，置于25℃电热恒温培养箱中黑暗条件下直接浸提。分别在浸提 1、2、4、8、12、16、20、24、48、72、96、120 h进行取样测定。当用肉眼观察愈伤组织完全变白时，即说明浸提完全，定容至25m L容量瓶中，摇匀，即得待测样品。

1.2.3 分光光度计法测定叶绿素含量 取一定量的叶绿素待测溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，将续滤液置于厚1cm的比色皿中，用相应提取液作参比，在UV BlueStar A分光光度计上测定645nm和663nm处的光密度值。再用Arnon法公式计算叶绿素含量。公式如下：

Ca=12.7D663-2.69D645

Cb=22.9D645-4.68D663

Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663

式中 Ct：总叶绿素浓度；Ca、Cb：叶绿素 a、b 的浓度，mg·L-1。

1.2.4 数据统计 用spss 22.0进行所有数据的统计分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同提取液中叶绿素的吸收光谱扫描

如图1所示，3种不同叶绿素提取液在波长500～700nm范围内吸收光谱基本相似，且最大吸收波长约在660nm，说明所用提取液提取的叶绿素溶液化学性质基本相同，符合Arnon公式的计算要求，可以采用该公式计算相应的叶绿素含量。

图1 龙胆愈伤组织在不同提取液中吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum of chlorophyll in different extraction agents in gentian callus（Note:A,B,C respectively represent acetone:absolute ethanol:distilled water-12∶6∶0,12∶6∶2,12∶0∶3）

2.2 不同提取液对叶绿素提取率的影响

用不同提取液对龙胆愈伤组织进行提取，结果表明，48h内3种提取液中叶绿素含量持续上升（见图2）。无水丙酮与乙醇混合液提取的叶绿素含量较高于含10%水的混合液提取率，但显著高于80%丙酮提取液提取的叶绿素含量。龙胆愈伤组织浸提2h后，采用提取液A提取的叶绿素含量最高为2.11 mg·g-1，其次是提取液 B 组 1.87mg·g-1，第三是 C 组80%丙酮为 1.71m·g-1。从浸提 4、8、16、24和 48h后看，A组叶绿素提取效果与另外2种提取液比，有显著性差异（p＜0.05）。

图2 不同提取液对龙胆愈伤组织中叶绿素提取效果的影响Fig.2 Effects of differentextraction agents on the chlorophyll content in gentian callus

2.3 不同提取液对叶绿素稳定性的影响

连续监测120h后发现，不同提取液对龙胆愈伤组织中叶绿素稳定性的影响也不同（见表1）。

表1 不同提取液对叶绿素稳定性的影响（mean±SD，n=3）Tab.1 Effects of differentextraction agents on on the stability of chlorophyllin gentian callus（Mean±SD,n=3）

在经过48h持续上升后，叶绿素含量出现不同程度的下降，尤其是提取液C组80%丙酮叶绿素含量下降最多，这表明提取液中含水量越多，叶绿素越不稳定。叶绿素提取液放置120h后，叶绿素a下降37.93%～28.82%，叶绿素b下降30.63%～25.31%，叶绿素a与叶绿素b比值下降10%左右，据此可推测叶绿素b比叶绿素a稳定。

3 结论

由本试验结果看，选用丙酮和无水乙醇混合提取液提取叶绿素的效果较好，比例以2:1较佳。传统的80%丙酮法由于含水量过高，导致叶绿素极不稳定性，提取速度慢，测定值偏低，应慎重采用。

龙胆中龙胆苦苷的生物合成途径较为复杂，主要通过细胞质中MVA途径或者在质体中通过MEP途径合成萜类前体物质IPP，然后转化为GPP[6]。叶绿体属于质体中一种，其中叶绿素含量高低可能会影响龙胆苦苷合成途径的具体走向，同时也为次生代谢产物研究、人工栽培驯化及建立繁育基地缓解野生药用资源匮乏和扩大新药源的有效途径提供技术平台。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015版一部）［S］.北京:中国医药科技出版社,2015.95.

［2］ Chang-Liao W L,Chien C F,Lin L C,et al．Isolation of gentiopicroside from Gentianae Radix and its pharmacokinetics on liver ischem ia/reperfusion rats［J］.JEthnopharmacol,2012,141（2）:668-673.

［3］ 王爱玉,张春庆,等.玉米叶绿素含量快速测定方法研究［J］.玉米科学,2008,16（2）:97-100.

［4］ 曾建敏,姚恒,等.烤烟叶片叶绿素含量的测定及其与SPAD值的关系［J］.分子植物育种,2009,7（1）:56-62.

［5］ 薛香,吴玉娥.小麦叶片叶绿素含量测定及其与SPAD值的关系［J］.湖北农业科学,2010,49（11）:2701-2702.

［6］ 王彩云,张晓东，等.龙胆苦苷生物合成途径研究进展［J］.江苏农业科学,2014,42（3）:4-10.

Chlorophyll content determ ination in gentian callus*

CHENG Yu-peng1,2,MA Ai-ping1,WANG Hong-yue1,NING Yuan1,LITian-cong1,LIHong-kun1
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Harbin Normal University,Harbin 150025,China

To study the effects of different extraction agents on the chlorophyll content in gentian callus by UV-vis spectrophotometry.The results indicated that chlorophyll absorption spectrum was similar,however,chlorophyll content and stability had significant effects with different extraction agents.As water content of extraction agents increasing,the stability and the extraction rate of chlorophyll significantly decreased.Chlorophyll b wasmore stable than Chlorophyll a.The better extraction that acetone:absolute ethanol（2:1）is used for the content determination of chlorophyll in bulk samples.

gentian callus;chlorophyll;content determination

R284

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170425

2017-01-16

黑龙江中医药大学研究生创新科研项目（yjscx2016046）

程玉鹏（1966-），男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事中药生物技术应用研究。