木质纤维生物质对纤维素酶的可及性测定方法研究进展

吴琳梅，丁 锐，薛绍礼，夏觅真

(安徽医科大学生命科学学院，安徽 合肥 230032)

木质纤维生物质对纤维素酶的可及性测定方法研究进展

吴琳梅，丁 锐，薛绍礼，夏觅真*

(安徽医科大学生命科学学院，安徽 合肥 230032)

木质纤维生物质通过酶解转化成乙醇燃料和化工产品具有广阔的应用前景，但木质纤维生物质的结构和组成复杂，阻碍了其活性位点与纤维素酶的结合，不利于酶解的进行。对木质纤维生物质进行预处理，可以改善其结构，提高其对纤维素酶的可及性，从而提高酶解效率。重点概述了西蒙染色法、溶质排阻法、蛋白质吸附法等可及性测定方法,分析比较了各方法的优缺点,并对可及性测定方法的研究方向进行了展望。

木质纤维生物质；纤维素酶；可及性；酶解；预处理

木质纤维生物质占地球植物生物质的90%以上，是丰富的可再生资源。利用纤维素酶将木质纤维生物质降解成可发酵单糖，然后发酵生产液体燃料及化工产品，对于解决能源危机、环境污染等难题有着非常重要的意义[1-2]。但是，酶解效率低限制了木质纤维生物质的有效利用，而木质纤维生物质对纤维素酶的可及性低是造成酶解效率低的重要原因[3-4]。可及性是指单位量的木质纤维生物质中可以与纤维素酶结合且能够被酶降解或微生物利用的结合位点量。一般而言，只有当木质纤维生物质表面位点与纤维素酶接触、吸附结合后，才有可能进一步被酶降解成可发酵单糖，因此，可及性是基于酶解的生物处理中最根本的限制因素[3]。然而，木质纤维生物质细胞壁微观结构的复杂性、主要组分(木质素、半纤维素及纤维素)分布的不均一性以及纤维素的超分子结构形成了天然的抗降解屏障，阻碍了纤维素酶与木质纤维生物质的结合，不利于酶解，因此，木质纤维生物质在酶解前要进行预处理，破坏生物质细胞壁抗降解屏障[5]。

目前，关于木质纤维生物质预处理的研究报道较多[6-7]。虽然预处理的方法和手段不尽相同，但主要目的一致，即除去木质纤维生物质中的木质素与半纤维素、降低纤维素的结晶度和聚合度、增大纤维素的表面积和孔隙率等，使得木质纤维生物质具有适宜的结构特征，提高其对纤维素酶的可及性，从而提高酶解效率。可及性作为评价木质纤维生物质预处理效果的重要依据，为不同木质纤维生物质的预处理方法选择提供了理论指导。但采用不同方法测定的可及性有所差异，而国内外至今还没有统一的可及性测定方法和标准。鉴于此，作者从原理、应用等方面对可及性测定方法进行简述，以期为木质纤维生物质对纤维素酶可及性测定方法的深入研究提供参考。

1 间接法测定可及性

间接测定法与木质纤维生物质的孔道结构(孔径、孔隙率、孔形貌)和内表面积有关。植物细胞壁孔径太小(5～10 nm)，阻碍酶扩散，孔径应当至少在50～100 nm范围内酶才能够充分地扩散[8]。孔道结构的测定方法能够作为可及性的间接评价方法，其中，常用的保水值法和BET法因水和氮气分子的直径远小于纤维素酶，误差较大；而西蒙染色法(Simons′ stain)和溶质排阻法(solute exclusion)在一定程度上弥补了上述缺陷。

1.1 西蒙染色法

西蒙染色法是一种简单易行的可及性半定量测定方法，主要通过直接蓝1(direct blue 1 dye，CI constitution No.24410)和直接橙15(direct orange 15 dye，CI constitution No.40002/3)这2种染料在木质纤维生物质上的竞争吸附来评价木质纤维生物质对纤维素酶的可及性[9]。直接蓝1分子尺寸小(直径约1 nm)、对纤维素的亲和力弱，而直接橙15分子尺寸大(直径5～36 nm)、对纤维素有很强的亲和力[9]。当这2种染料分子共同作用于纤维素时，亲和力强的直接橙15大分子优先吸附在大孔中，并将大孔中已吸附的直接蓝1替换出来，致使直接蓝1只能吸附在纤维素的小孔中。因此，直接蓝1与直接橙15的吸附量能指示纤维素结构中大孔与小孔的量。同时，由于直接橙15的分子尺寸与内切葡聚糖酶的催化中心大小相似，所以其吸附量也常用作木质纤维生物质对纤维素酶可及性的评价指标。

A455=εO/455LcO+εB/455LcB

(1)

A624=εO/624LcO+εB/624LcB

(2)

(3)

式中：A455、A624分别为溶液在455 nm、624 nm处的吸光度；εO/455、εO/624分别为直接橙15在455 nm、624 nm下的消光系数；εB/455、εB/624分别为直接蓝1在455 nm、624 nm下的消光系数；L为比色皿内径；cO为直接橙15的浓度；cB为直接蓝1的浓度；q为吸附量；Kads为吸附平衡常数。

Chandra等[10-11]研究蒸汽处理、乙醇-有机溶剂处理、热处理等预处理方法对木质纤维生物质酶解效率及染料吸附量的影响时发现，乙醇-有机溶剂处理时的酶解效率最高、染料吸附量最大。因此，可以用B+O值表征可及性，B+O值增大时，可及性提高。此外，Arantes等[12]研究发现，可及性提高时O/B值也随之增大，水解底物所需酶量相应减少。

Meng等[13]通过西蒙染色法比较了稀酸处理和蒸汽爆破处理前后杨属生物质的孔道结构变化，从而研究预处理对可及性的影响。结果表明，杨属生物质未处理前B+O值为67.0 mg·g-1、O/B值为0.19；蒸汽爆破10 min后，B+O值为80.7 mg·g-1、O/B值为0.25；稀酸处理10 min后，B+O值为100.1 mg·g-1、O/B值为0.39。相对于蒸汽爆破，稀酸处理的B+O值与O/B值均较高，说明稀酸处理能有效提高杨属生物质对纤维素酶的可及性。

1.2 溶质排阻法

溶质排阻法：木质纤维生物质在不同尺寸的探针分子溶液中发生溶胀，部分水分子和溶质探针分子进入孔道结构中，导致溶质浓度发生改变，通过测定孔体积或内表面积来评价木质纤维生物质对纤维素酶的可及性。探针分子必须满足以下条件：不与木质纤维生物质发生相互作用、非电解质、分子量分布窄、在溶液中呈球形等[14]。葡聚糖(dextran)与聚乙二醇(PEG)为常用的探针分子，其平均分子量及分子直径见表 1。

表1探针分子的平均分子量与分子直径

Tab.1Average molecular weight and molecular

西蒙染色法与溶质排阻法均是基于对木质纤维生物质的孔道结构表征来评价可及性。区别在于：西蒙染色法是基于预处理前后孔数量变化(B+O值作为依据)及大孔与小孔所占比例的变化(O/B值作为依据)来评价可及性；而溶质排阻法是基于孔体积及内表面积的变化来评价可及性。木质纤维生物质具有外表面积与内表面积，外表面积主要与木质纤维生物质的颗粒大小有关，内表面积与孔壁面积有关。研究表明，90%的酶解效率由底物中酶可及的内表面积(孔壁面积)贡献[15]。因此，木质纤维生物质的内表面积是评价可及性的另一重要指标。

目前，溶质排阻法没有统一的操作标准，但测定流程相似：将一定量的木质纤维生物质置于一定尺寸的探针分子溶液(葡聚糖或聚乙二醇溶液)中进行膨胀处理，静置一段时间后取上清液，离心，用HPLC法测定上清液中溶质的浓度。溶质排阻法的关键是利用溶质浓度的变化计算孔体积及内表面积。溶质浓度的变化满足质量守恒定律[16]：

(4)

式中：δi为以分子直径为i的探针分子为溶质时单位木质纤维生物质孔道中可及水分子的质量，g·g-1；w为溶质溶液的初始质量，g；q为木质纤维生物质所含水的质量，g；P为木质纤维生物质的干量，g；c0与c分别为溶质初始浓度与离心后上清液中溶质的浓度，%。

水的密度以1 g·mL-1计，则δi=Vi(水分子所占据的孔道体积)。因此，分子直径为i的溶质分子所占据的孔道体积Va=Vall-Vi(式中Vall为孔道总体积)。若以聚乙二醇为探针分子，则Vall等于以平均分子量在3 350～10 000之间的聚乙二醇探针分子所计算出的Vi平均值[17]；若以葡聚糖为探针分子，Vall等于以分子直径为560 Å的葡聚糖分子dextran T2000所计算出的Vi值。因为，dextran T2000探针分子的尺寸最大(560 Å)，很难进入木质纤维生物质的孔道结构中，孔道可全部被水分子占据，所以Vall=Vi[18]。若假设所有的孔洞都是圆柱形，分子直径为m的探针分子对木质纤维生物质的可及孔面积(accessible pore surface，CAPm)可表示为[18]：

(5)

已知纤维素酶的分子直径约为51 Å[19]，若利用分子直径相当的葡聚糖作为探测分子，可以较为准确地表征木质纤维生物质对纤维素酶的可及孔面积和孔体积。

Wang等[18]以葡聚糖为探针分子，通过溶质排阻法研究了稀酸(DA)处理及不同pH值下亚硫酸盐(SPORL)处理对黑松的孔径分布及酶解效率的影响。结果表明，与未经处理和稀酸处理相比，亚硫酸盐处理的底物在51～200 Å范围内含有更多的孔洞(图 1[20])，促进了酶解效率的提升，说明亚硫酸盐处理可显著提高黑松对纤维素酶的可及性。

图1 不同预处理法制备的底物的孔径分布Fig.1 Pore size distribution of substrates prepared bydifferent pretreatment methods

Meunier-Goddik等[21]利用溶质排阻法研究了稀酸处理(0.6% H2SO4，10 min，180 ℃)对杨木的酶可及表面积的影响，结果与Wang等[18]相似，未处理杨木的酶可及表面积为36 m2·g-1，稀酸处理后其酶可及表面积增大到115 m2·g-1，纤维素转化率由8%升高到78%。Duan等[22]利用溶质排阻法研究了干燥过程对硬木溶解纸浆的可及表面积及纤维素酶吸附量的影响，结果表明，未干燥纸浆的可及表面积为21.6 m2·g-1，105 ℃下干燥4 h后纸浆的可及表面积缩小到4.3 m2·g-1，纤维素酶吸附量也相应减少。

2 直接法测定可及性

直接法测定可及性与间接法的区别在于：间接法是利用染料分子(直接蓝1和直接橙15)的吸附或者溶质分子(葡聚糖或聚乙二醇)浓度的变化来表征底物孔道结构(孔道数量、孔体积、内表面积)的变化，从而评价可及性；而直接法是基于纤维素结合结构域(cellulose binding module,CBM)与底物的相互作用来评价可及性。自然界中纤维素酶种类繁多，大多是由相对独立的2种结构域组成：催化结构域(CD)和CBM。通过CBM与木质纤维生物质的吸附作用增强不溶性纤维素对纤维素酶的可及性，扩大底物附近的酶浓度，最终提高酶解效率。一般而言，不直接采用吸附纤维素酶的方法来测定可及性。因为，为了防止纤维素酶水解底物，吸附实验通常在低温(4 ℃)下进行，但低温下的纤维素酶的吸附特性与水解温度下的吸附特性相差甚远，因此，可构造含有CBM的非水解蛋白，并以其为探针分子，通过计算底物对蛋白质探针分子的吸附量来评价可及性。

Hong等[23]利用融合技术构造出含有3个CBM和绿色荧光蛋白(GFP)的非水解融合蛋白TGC，其分子直径与纤维素酶分子直径相近，通过酶标仪检测溶液中木质纤维素底物未吸附的TGC浓度，并通过Langmuir方程计算出TGC的最大吸附量，从而评价纤维素酶的可及性(CAC,m2·g-1)。可及性的计算满足以下关系式：

CAC=αWmaxNAAG2/(106×S)

(6)

式中：α为纤维素晶面上吸附TGC分子的数量；Wmax为TGC分子的最大吸附量，μmol·L-1；NA为阿伏伽德罗常数；AG2为纤维素110晶面的面积，5.512×10-19m2；S为木质纤维素的浓度，g·L-1。

Hong等测定的再生无定形纤维素的CAC值为41.9 m2·g-1；细菌微晶纤维素的CAC值为33.5 m2·g-1，Whatman 1号滤纸的CAC值为9.76 m2·g-1，Avicel的CAC值为2.38 m2·g-1。

何品晶等[24]发明了一种可视化的、原位测定木质纤维生物质对纤维素酶可及性的方法：以纤维小体荧光蛋白为探针分子，通过荧光光度计计算单位面积吸附探针分子的量，并用荧光显微镜原位观测和计数木质纤维生物质样品上荧光标记的酶结合位点来评价可及性。纤维小体荧光蛋白探针是一种采用荧光蛋白标记的纤维小体片段，其蛋白序列包括2部分，一端是来自于微生物纤维小体的纤维素结合模块蛋白，另一端是荧光蛋白。木质纤维生物质的酶结合总位点包括不可降解的酶结合位点(纤维素酶与生物质中的木质素结合)和可降解的酶结合位点(纤维素酶与生物质中的纤维素结合)。利用牛血清白蛋白封闭不可降解的酶结合位点，用纤维小体荧光蛋白探针标记可降解的酶结合位点。纤维素酶结合位点的平均荧光值占酶结合总位点平均荧光值的百分比越大，则可及性越强。

3 结语

近年来，关于预处理可提高木质纤维生物质对纤维素酶的可及性及酶解效率的观点已经得到了越来越多的证实。但目前关于可及性测定方法尚无统一标准。虽然，西蒙染色法、溶质排阻法及蛋白质吸附法等均可用于测定可及性，但每种方法都存在一定的局限性。西蒙染色法简单快捷，但只能对可及性进行半定量测定，且测定过程中易受到孔形状的影响；溶质排阻法能够对可及性进行定量测定，但只能对内表面积测定，无法反映出外表面积变化情况，也易受孔形状的影响；蛋白质吸附法所用探针蛋白质虽然存在纤维素结合结构域且分子大小与纤维素酶相似，但在测定过程中部分探针蛋白质会与木质素结合，造成测定误差。不管采用何种测定方法，最终都要以实际反应过程纤维素的酶解效率、生物质的转化率、还原性糖的产量等指标来验证可及性的测定结果。随着纤维素超分子结构及纤维素酶催化机理的深入研究，近来发现纤维素酶的吸附与催化反应发生在纤维素的疏水晶面。因此，基于对疏水晶面的数量和面积表征而建立起来的全新可及性测定方法还有待发展。

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ResearchProgressinDeterminationMethodsforAccessibilityofLignocellulosicBiomasstoCellulase

WU Lin-mei,DING Rui,XUE Shao-li,XIA Mi-zhen*

(CollegeofLifeSciences,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

The conversion of lignocellulosic biomass into ethanol fuels and chemical products through enzymolysis has a broad application prospect.However,the complicated structure and composition of lignocellulosic biomass prevent the combination of its active site and cellulase,and limit the enzymolysis.Pretreatment of lignocellulosic biomass can improve the structure,enhance the accessibility to cellulase,and thus improve enzymolysis efficiency.In this paper,we analyze and compare advantages and disadvantages of accessibility determination method(such as Simons′ stain,solute exclusion,and protein adsorption),and point out the direction for their research.

lignocellulosic biomass;cellulase;accessibility;enzymolysis;pretreatment

Q556 O629.8

A

1672-5425(2017)10-0001-05

安徽医科大学博士科研基金项目(0807016101)

2017-04-24

吴琳梅(1988—)，女，贵州三都人，讲师，研究方向：木质纤维生物质的转化与利用，E-mail:wlm88.1.26@126.com；通讯作者：夏觅真，副教授，E-mail:xiamizhena@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.001

吴琳梅，丁锐，薛绍礼,等.木质纤维生物质对纤维素酶的可及性测定方法研究进展[J].化学与生物工程，2017，34(10)：1-5.