水不溶性条斑紫菜多糖酸水解的研究

王灵昭，周晓婉，汪维喜，王纪丰，吕玲玲，舒留泉，姚兴存，吴胜军，焦宇，王玉良

1(淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室/海洋生命与水产学院,江苏 连云港,222005) 2 (连云港西墅物产有限责任公司,江苏 连云港,222042)

水不溶性条斑紫菜多糖酸水解的研究

王灵昭1,2*，周晓婉1，汪维喜2，王纪丰1，吕玲玲1，舒留泉1，姚兴存1，吴胜军1，焦宇1，王玉良1

1(淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室/海洋生命与水产学院,江苏 连云港,222005) 2 (连云港西墅物产有限责任公司,江苏 连云港,222042)

小分子多糖水解产物能够克服大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足。文中对水不溶性条斑紫菜多糖的盐酸水解进行研究。结果表明，盐酸水解多糖的最适条件为，酸浓度0.050 mol/L，温度80 ℃，时间2.0 h。水解产物中还原糖占总糖的0.24%，低聚糖产物可能为二糖或三糖。产物的红外光谱分析表明粉状样品是含硫酸基的β-糖苷键连接的吡喃型低聚糖，其具有糖环内醚结构。产物的紫外光谱分析表明粉状样品含有蛋白质，进一步分析表明样品含有蛋白质6.88%、总糖88.92%。

条斑紫菜；水不溶性多糖；酸水解；红外光谱；紫外光谱

干紫菜含25%～50%的蛋白质(藻胆蛋白占紫菜干重的4%左右)，20～40%的糖类[1-2]。藻胆蛋白具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化、抗衰老等生物活性，在食品、药品和化妆品领域具有广阔的潜在市场[3]。紫菜多糖具有免疫调节、降血脂、降血糖、抗凝血、消炎、抗疲劳、抗衰老、抗辐射、抗流感病毒、抗癌等生物学功能，在食品、药品和化妆品领域具有广阔的应用前景[3-5]。因此，从含量及应用价值来看，紫菜的高值化利用应重点关注藻胆蛋白和多糖。

目前，对紫菜藻胆蛋白和多糖的开发，普遍以干紫菜为原料或将鲜紫菜干燥后进一步研究[6-10]。这种作法存在弊端：一是干燥可能会导致蛋白质变性而降低藻胆蛋白的活性；二是10～13 kg的鲜紫菜干燥后仅能得到1 kg干紫菜，且干燥过程会消耗大量热能。因此，研究以鲜紫菜为原料制备藻胆蛋白和多糖的技术具有实际意义和价值。笔者提出了一种以鲜紫菜为原料，同时制备藻胆蛋白和多糖的新技术，但该技术体系产生水不溶性紫菜多糖[11]。多糖水解产物具有增强免疫、抗肿瘤、降血糖、降血压、增强机体免疫等生理作用[12]，尤其是其水解产物分子质量小的优点能够克服大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足[13]。因此，本文重点研究水不溶性紫菜多糖的酸水解，以开发条斑紫菜中的水不溶性多糖。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

条斑紫菜(Porphyrayezoensis)：由连云港西墅物产有限责任公司提供。试剂纯度为分析级或更高级。

1.2仪器与设备

PS100型平板式离心机，张家港市乐余润捷机械厂；MTK 662型斩拌机，马多(北京)机械制造有限公司；CMD2000/4高剪切研磨分散机，切可(上海)机械设备有限公司；MS1001L2K高压均质机，意大利GEA Nliro Soavi公司；CR-22N流体离心机，日本日立仪器有限公司；多用途台式高速冷冻离心机，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Agileng1200高效液液相色谱仪，安捷伦科技有有限公司；Alltech3300蒸发光散射检测器，美国格瑞斯公司；Nexus-870傅立叶变换红外光谱仪，美国NICOLET公司；769YP-15A压片机，北京天创尚邦仪器有限公司；Lambda35紫外/可见分光光度计，美国Perkin Elmer公司。

1.3实验方法

1.3.1 水不溶性条斑紫菜多糖的制备

以鲜条斑紫菜为原料制备藻胆蛋白和多糖的技术路线参照前期研究[11]，做如图1所示的改动。如图1所示，将采收的条斑紫菜离心脱水后于-20 ℃下冻藏备用。将冻藏紫菜斩拌，加入pH 8.0的KH2PO4-NOH缓冲液(缓冲液/紫菜质量比=1/1)于40 ℃下溶胀9 h，用高剪切研磨分散机超微粉碎后加水稀释(物料/水(质量比)=1/1)，然后于80 MPa下高压均质。将均质后的物料用流体离心机离心，获得的沉淀物即为水不溶性紫菜多糖，用于酸水解研究。

图1 制备藻胆蛋白和多糖的技术路线Fig.1 Technical route for preparingphycobiliproteins and polysaccharides

1.3.2 紫菜多糖酸水解的影响因素

1.3.2.1 酸浓度对多糖水解的影响

加水稀释不溶性紫菜多糖的干物质含量至3%，然后加入HCl使体系的酸浓度分别达到0.010、0.025、0.050、0.075、0.100 mol/L。体系在75 ℃下反应1 h，冷却至室温，用NaOH溶液调节至pH值7.0，离心得上清液，分析上清液中的总糖含量。

1.3.2.2 温度对多糖水解的影响

加水稀释不溶性紫菜多糖的干物质含量至3%，然后加入HCl使体系的酸浓度达到0.050 mol/L。体系分别在65、70、75、80、85 ℃下反应1 h，冷却至室温，用NaOH溶液调节至pH 7.0，离心得上清液，分析上清液中的总糖含量。

1.3.2.3 时间对多糖水解的影响

加水稀释不溶性紫菜多糖的干物质含量至3%，然后加入HCl使体系的酸浓度达到0.050 mol/L。体系在80 ℃下分别反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，冷却至室温，用NaOH溶液调节至pH 7.0，离心得上清液，测定上清液中的总糖含量。

以溶出率为指标衡量水不溶性紫菜多糖的酸水解，其定义为上清液中总糖含量占所消耗的水不溶性紫菜多糖中干物质含量的百分比。

1.3.3 水解率及产物中低聚糖组分分析

测定最适酸水解条件下上清液的还原糖含量，分析水解率。水解率定义为上清液中还原糖含量占总糖含量的百分比。

将上清液样品真空旋转蒸发至原体积的1/5，用4倍体积的95%乙醇醇沉12 h，离心处理去除上清液。添加少量丙酮摇匀后重复上述操作，再加无水乙醇重复上述操作。然后，样品置通风橱中通风30 min，于45～55 ℃下干燥后将粉状样品置于干燥器中备用。采用高效液相色谱-蒸发光散射法分析粉状样品中低聚糖分子质量分布，取麦芽糖(Mr=342.30)，葡萄糖(Mr=180.16)作为对照品。色谱条件：ZORBAX NH2色谱柱，柱温30 ℃；进样量10 μL；流动相：V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速1 mL/min； 蒸发光散射器参数：漂移管温度80 ℃，N2流速2.0 L/min。

1.3.4 产物的红外光谱分析

粉状样品的红外光谱分析采用KBr压片法，薄片放入红外光谱仪中进行4 000～400 cm-1范围的扫描。

1.3.5 产物的紫外光谱、蛋白质含量及总糖含量分析

将粉状样品配成0.05 g/L样液，然后用紫外扫描仪进行200～400 nm的扫描。采用Bradford法测定粉状样品的蛋白质含量。此外，分析粉状样品的总糖含量。

1.3.6 化学及统计分析

2 结果与讨论

2.1紫菜多糖酸水解的影响因素研究

2.2.1 酸浓度对多糖水解的影响

由图2可知，酸浓度为0.050 mol/L时溶出率最大，酸浓度为0.075 mol/L时溶出率次之，但两者的差异不显著(p>0.05)。但是，酸浓度为0.025或0.100 mol/L时，溶出率均比0.050 mol/L酸浓度时的溶出率显著降低(p<0.05)。糖类化合物在酸和热的作用下，能够发生复合和分解反应而生成一些非糖类化合物。根据苯酚硫酸法测总糖的原理，这些反应会降低总糖的测定值，因此酸浓度过高会导致溶出率降低。综合考虑，最适酸浓度为0.050 mol/L。

图2 酸浓度对多糖水解的影响Fig.2 Effect of acid concentration on polysaccharide hydrolysis注：标有不同字母的指标值具有显著性差异(p<0.05)。图3、图4同。

2.2.2 温度对多糖水解的影响

由图3可知，不超过80 ℃时，溶出率随着温度的增加而显著增加(p<0.05)；85 ℃比80 ℃的溶出率有所增加，但不显著(p>0.05)。多糖酸水解的温度过高，反而会导致糖类化合物发生脱水反应，生成糠醛、羟甲基糠醛和酚类等副产物，使总糖收率下降，且温度过高耗费能量大。综合考虑，最适温度为80 ℃。

图3 温度对多糖水解的影响Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide hydrolysis

2.2.3 时间对多糖水解的影响

由图4可知，不超过2.0 h时，溶出率随着时间的增加而显著增加(p<0.05)；2.5 h比2.0 h的溶出率有所增加，但不显著(p>0.05)。时间过长，水解液会产生一些非糖类化合物，且糖类化合物容易碳化而导致总糖收率降低。综合考虑，最适时间为2.0 h。

图4 时间对多糖水解的影响Fig.4 Effect of time on polysaccharide hydrolysis

2.2水解率及产物中低聚糖组分分析

水解率的分析结果为(0.24±0.11)%。根据水解率的定义可知，水解产物的上清液中还原糖含量占总糖含量的百分比为0.24%，还原糖含量较低。水解率较低的原因可能在于水解过程中糖类物质的自由醛基或酮基易被氧化所致，也可能在于水解产物多为非还原糖，相关解释需要深入研究。

采用高效液相色谱法分析产物中低聚糖组分。如图5所示，图5-A和5-B分别是对照品(葡萄糖、麦芽糖)和水解物样品的色谱图。由图5-A可知，葡萄糖和麦芽糖的保留时间分别为10.597 min和12.874 min；由图5-B可知，水解物样品仅在13.817 min处出峰，说明产物中低聚糖组分单一。氨基柱已成功地用于低分子糖的分析，乙睛-水作为流动相时的出峰顺序为单糖、双糖和较高聚合度的低聚糖[14]。植物多糖的盐酸水解得到的寡糖主要为单糖和双糖，四糖以上的寡糖含量非常低[12]。因此，由图5中的保留时间可知，产物中低聚糖可能是双糖或三糖，其结构信息需要深入研究。

图5 对照品(A)和水解物样品(B)的高效液相色谱Fig.5 High performance liquid chromatography of control samples (A) and hydrolysate sample (B)

2.3产物的红外光谱分析

图6 红外光谱Fig.6 Infrared spectrum

2.4产物的紫外光谱、蛋白质含量及总糖含量分析

由图7可知，在260～280 nm附近有明显吸收峰，说明样品含有蛋白质。采用Bradford法测定样品的蛋白质含量，结果表明粉状样品含有蛋白质(6.88±0.07)%，该结果验证了红外光谱1 655 cm-1处吸收峰表明的是酰胺键中N—H键的变角振动，其强吸收峰说明了样品含有较高的蛋白质。此外，粉状样品含有总糖(88.92±0.49)%。

图7 紫外光谱Fig.7 Ultraviolet spectrum

3 结论

采用盐酸水解水不溶性紫菜多糖，研究了多糖酸水解的影响因素、水解率、低聚糖组成，以及产物的红外光谱、紫外光谱和蛋白质含量等问题。结果表明，多糖酸水解的最适条件为：酸浓度0.050 mol/L，温度80 ℃，时间2.0 h。水解产物中还原糖占总糖的0.24%，产物为低聚合度的二糖或三糖。产物的红外光谱分析表明粉状样品是含硫酸基的β-糖苷键连接的吡喃型低聚糖，其具有糖环内醚结构。产物的紫外光谱分析表明粉状样品中含有蛋白质，进一步分析表明样品含有蛋白质6.88%、总糖88.92%。研究工作对高值化开发条斑紫菜时产生的水不溶性多糖的再利用具有重要价值。

[1] 张全斌,赵婷婷,綦慧敏,等.紫菜的营养价值研究概况[J].海洋科学,2005,29(2):69-72.

[2] 姚兴存,邱春江,穆春林.条斑紫菜营养成分与季节变化研究[J].水产养殖,2002(5):34-35.

[3] 叶翠芳.紫菜提取物及其抗紫外辐射活性的研究[D].广州:暨南大学,2012.

[4] ZHANG Lu-xi,CAI Chun-er,GUO Ting-ting,et al.Anti-cancer effects of polysaccharide and phycocyanin fromPorphyrayezoensis[J].Journal of Marine Science and Technology,2011,19(4):377-382.

[5] LI Qian,ZHOU Yan,MA Jian-xin.Hypolipidemic effect of the polysaccharides fromPorphyrayezoensis[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,68:48-49.

[6] 赵婷婷.不同分子量坛紫菜多糖的制备及其抗衰老活性研究[D].青岛：中国科学院海洋研究所,2007.

[7] 朱晓君,安辛欣,顾丽,等.超声辅助同时提取条斑紫菜多糖及藻胆蛋白工艺的优化[J].食品科学,2008,29(5):241-244.

[8] 蔡春尔,周铭,李春霞,等.条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索[J].生物技术通报,2009(2):98-102.

[9] 胡秋辉,顾俊,施瑛,等.一种高纯度紫菜多糖的酶辅助提取方法.2011102534495[P].2011-12-07.

[10] 马海乐,王婷,任晓锋,等.紫菜蛋白与多糖混合产品的交替双频逆流超声辅助同时提取方法[P].2012103188386.2013-01-09.

[11] 王灵昭,苏琳,姚兴存,等.一种利用条斑紫菜制备粗藻胆蛋白及粗多糖的方法.105111278A[P].2015-12-02.

[12] 缪月秋,顾龚平,吴国荣.植物多糖水解及其产物的研究进展[J].中国野生植物资源,2005,24(2):4-7.

[13] HIRAYAMA M.Novel physiological functions of oligosaccharides[J].Pure and Applied Chemistry,2002,74(7):1 271-1 279.

[14] 张媛媛,聂少平,万成,等.高效液相色谱—蒸发光散射检测法同时测定单糖、双糖及低聚果糖[J].食品科学,2009,30(18):237-239.

[15] ZHANG Quan-bin,QI Hui-min,ZHAO Ting-ting,et al.Chemical characteristics of a polysaccharide fromPorphyracapensis(Rhodophyta)[J].Carbohydrate Research,2005,340(15):2 447-2 450.

[16] 黄璐,王洪旭,殷廷,等.PMP-HPLC-MS分析扇贝内脏多糖的组成[J].食品工业科技,2015,36(7):113-117.

[17] 林春香,刘丹慧,骆微,等.核-壳含氟硅织物整理剂的可控制备及其表征[J].功能材料,2014,45(22):22 070-22 074.

[18] 刘春兰,周博,杜宁,等.大黄橐吾水溶性多糖的初步纯化及清除自由基活性研究[J].中央民族大学学报:自然科学版,2007,16(4):341-345.

[19] QIAO De-liang,LIU Jun,KE Chun-ling,et al.Structural characterization of polysaccharides from Hyriopsis cumingii[J].Carbohydrate Polymers,2010,82(4):1 184-1 190.

[20] 邓利玲,钟耕,刘倍毓,等.半干法酶解制备的魔芋葡甘低聚糖性质[J].食品科学,2013,34(15):115-119.

[21] 林晓芝,唐渝,张渊明,等.海藻多糖的组成及结构光谱分析[J].化学通报:印刷版,2005,68(12):911-917.

[22] 王如涛.红豆杉单组份多糖的分离,结构特性分析和对心肌细胞作用的研究[D].杭州：浙江大学,2013.

[23] 叶诚,周蓬蓬,余龙江,等.高相对分子质量裂褶多糖的制备与结构鉴定[J].生命科学研究,2007,11(2):100-104.

[24] 吕荣湖,张红岩,于建宁.阳离子型改性淀粉絮凝剂的制备及絮凝性能研究[J].中国石油大学学报：自然科学版,2006,30(4):118-122.

Investigationofacidhydrolysisofwater-insolublepolysaccharidefromPorphyrayezoensis

WANG Ling-zhao1,2*,ZHOU Xiao-wan1,WANG Wei-xi2, WANG Ji-feng1,LYU Ling-ling1,SHU Liu-quan1,YAO Xing-cun1, WU Sheng-jun1,JIAO Yu1,WANG Yu-liang1

1(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology/College of Marine Life and Fisheries, Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China) 2(Lianyungang Xishu Material Co.,Ltd.,Lianyungang 222042,China)

Small molecular weight hydrolysates from polysaccharide hydrolysis are better than big molecular weight polysaccharides on the solubility and bioavailability. In this work, the hydrolysis of water-insoluble polysaccharides fromPorphyrayezoensiswas investigated using hydrochloric acid method. The optimal conditions for hydrolyzing polysaccharides were determined as: acid concentration 0.050 mol/L, 80 ℃ reacted for 2.0 hours. In the hydrolysates, the ratio of reducing sugar to total sugar was 0.24%, and the oligosaccharide product could be disaccharide or trisaccharide. The infrared spectrum of powder hydrolysates showed they were pyranoses with sulphuric groups, β-glucosidic bonds and cyclic ether structure. The ultraviolet spectrum of powder hydrolysates showed they contained proteins, and further analysis demonstrated the powder hydrolysates contained 6.88% protein, and 88.92% total sugar.

Porphyrayezoensis; water-insoluble polysaccharide; acid hydrolysis; infrared spectrum; ultraviolet spectrum

博士，副教授(本文通讯作者，E-mail：wanglz@hhit.edu.cn)。

连云港市科技项目(CXY1419)；连云港市科技项目(CN1503)

2017-04-13，改回日期：2017-05-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014521