云南省特色水果中多酚化合物含量和抗氧化性的比较

罗恒国，杨士花，李晴，罗瑜，黄勇桦，初雅洁，李淳，李永强*

1(云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明，650201) 2(云南农业大学 外语学院，云南 昆明，650201) 3(大理农林职业技术学院，云南 大理白族自治州，671003) 4(永平县食品药品检验检测局，云南 永平，672660)

云南省特色水果中多酚化合物含量和抗氧化性的比较

罗恒国1，杨士花2，李晴1，罗瑜1，黄勇桦1，初雅洁3，李淳4，李永强1*

1(云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明，650201) 2(云南农业大学 外语学院，云南 昆明，650201) 3(大理农林职业技术学院，云南 大理白族自治州，671003) 4(永平县食品药品检验检测局，云南 永平，672660)

选用6种云南特色水果，利用Folin-Ciocalteau法测定可溶性和键合多酚含量，通过DPPH自由基清除能力、过氧化氢清除能力、总抗氧化能力、铁离子还原/抗氧化能力和还原能力测定其体外抗氧化活性，并对多酚含量和抗氧化活性进行比较。结果表明,香椿果中总多酚和键合多酚含量最高，分别达到(91.85±7.48)和(35.69±1.29) μmol FAE/g，与其他5种水果呈差异显著(p<0.05)，鸡嗉子果中可溶性多酚含量最高，达(60.28±7.98) μmol FAE/g，与其他水果呈差异显著(p<0.05)。香椿果中键合多酚的还原能力、总抗氧化能力和过氧化氢清除能力最高，多依果中可溶性多酚的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力最强，说明多酚化合物的抗氧化能力与水果品种、多酚含量和多酚种类存在一定关系。

云南省；特色水果；多酚；含量；抗氧化活性

云南植物资源丰富，具有植物王国的美称[1-2]。由于其特殊的地理环境和气候条件，野生水果种类繁多，产量较高。鸡嗉子果(Dendrobenthamiacapitata)、青刺果(PrinsepiautilisRoyle)、蛇皮果(Salaccazalacca)、粗梗稠李(Padusnapaulensis)、香椿(Toonasinensis)、多依果(Docyniadelavayi)是云南省常见的野生特色水果[3-7]，不但含有碳水化合物、微量元素、维生素、有机酸等营养物质，而且富含膳食纤维、黄酮和多酚等功能成分，具有抗氧化、抗衰老、预防心血管疾病、糖尿病、增强机体免疫力等功能[8]。

植物多酚(plant polyphenols)是广泛存在于植物体内的一类次生代谢物，具有较强的抗氧化以及清除自由基的能力[9-11]。多酚与纤维素、细胞壁多糖结合在一起形成键合多酚[12-15]。国内外大多数研究者主要研究了可溶性多酚，忽略了对键合多酚的研究。本研究通过提取分离可溶性和键合多酚，通过测定多酚含量和抗氧化能力，对青刺果、多依果、蛇皮果、粗梗稠李、鸡嗉子果和香椿果进行较为系统的研究。

1 材料与方法

1.1实验原料

云南省的特色水果：多依果购自云南省澜沧本地农贸市场，粗梗稠李购买于云南临沧本地农贸市场，鸡嗉子果购买于云南省富源县，青刺果购买于云南省曲靖市，蛇皮果、香椿果购买于玉溪市。

1.2实验试剂

1,1二苯基-2-苦基肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、Folin-Ciocalteu试剂、Trolox，sigam公司；三吡啶基三嗪(2,4，6-tris(2-pyridy1)-S-triazine, TPTZ)、2,2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azinobis(3-ethylbenzothia-zoline)-6-sulfonate, ABTS)、三氯乙酸(TCA)、FeCl3、H2O2、FeSO4、抗坏血酸，上海晶纯生化科技股份有限公司；阿魏酸、儿茶素，北京北纳创联生物技术研究院；其他试剂均为分析纯。

1.3实验器材

UV-1800CP紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；FA2004电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；PHS-3E数字型pH计，上海精密科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1原料的预处理

新鲜鸡嗉子果、多依果、香椿果、粗梗稠李、青刺果和蛇皮果洗净，保鲜袋密封，放入-24 ℃冷藏备用。

2.2可溶性多酚和键合多酚的提取分离[16-18]

分别将上述6种水果研磨后，准确称取1.0 g，用体积分数70%丙酮提取，离心得上清，为可溶性多酚化合物，残渣加入4 mol/L NaOH溶液水解，用浓HCl调节pH值为2，离心后取上清液，用V(上清液)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醚)=1∶1∶1萃取3次，合并有机相，真空旋转蒸干，甲醇定容得到键合多酚化合物粗提液。

2.3多酚含量测定[16-18]

多酚含量采用Folin-Ciocalteau法测定，具体方法如下：吸取多酚化合物粗提液0.5 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteau试剂，充分振荡，加入饱和NaCO3溶液，补加蒸馏水至总体积至10 mL，充分混匀，室温下避光反应35 min，于4 000 g离心10 min，取蓝色上清液于725 nm下测定吸光度，用甲醇代替多酚粗提液作为空白。以阿魏酸为标准品建立回归方程为：

y= 1.289x-0.003(R2=0.998 8)

(1)

式中：y为吸光度，x为阿魏酸浓度(μmol/L)，多酚含量以阿魏酸计，即每g样品所含总多酚相当于阿魏酸的当量(μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g)。

2.4抗氧化活性的研究

2.4.1 DPPH自由基清除能力测定[19-21]

分别取1 mL待测样品，添加4 mL DPPH甲醇溶液，充分振摇后，在暗处反应10 min，然后在517 nm下进行比色测定，并根据标准曲线计算DPPH自由基的清除能力。利用阿魏酸绘制标准曲线，标准方程为：

y=451.75x+32.31(R2=0.998 7)

(2)

式中：y为DPPH自由基清除能力，x为阿魏酸浓度(μmol)，自由基清除能力表示为1 g样品中阿魏酸的当量(μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g)。

(3)

式中：s为0.5 mL 样品粗提液加2 mL DPPH甲醇溶液；sb为0.5 mL 样品粗提液加2 mL甲醇溶液；c为2.5 mL DPPH甲醇溶液；cb为2.5 mL甲醇溶液。

2.4.2 铁离子还原/抗氧化能力测定(FRAP)[19-21]

FRAP溶液制备：准确吸取10 mL乙酸溶液(300 mmoL/L，pH 3.6)、l mL FeC13·6 H20(20 mmoL/L)和l mL TPTZ溶液(10 mmoL/L)，充分混匀，制备成FRAP溶液。

分别将样品加入3 mL FRAP溶液充分混合，混匀后于37 ℃下放置，4 min后在593 nm测定吸光度。并根据标准曲线计算FRAP还原氧化能力。利用硫酸亚铁绘制标准曲线，标准方程为：

y=6 240x+0.000 5(R2=0.998 4)

(4)

式中：y为吸光度，x为FeSO4的浓度(mmol/L)，还原力为每g样品中Fe2+浓度当量(mmol Fe2+equivalents(FE)/g)。

2.4.3 总抗氧化能力测定(TEAC)[19-21]

ABTS+·工作液制备：将ABTS(17 mmoL/L)与过硫酸钾(2.45 mmoL/L)2种溶液等体积混合，得到ABTS+·工作液。

分别取100 μL多酚粗提液加入3.8 mL ABTS+·工作液，室温下放置6 min 后于734 nm测定吸光度，并根据标准曲线计算ABTS+·清除能力。利用Trolox绘制标注曲线，标准方程为：

y=103.95x+1.566 3(R2=0.998 4)

(5)

式中：y为ABTS+·清除率，x为Trolox的浓度(mmol/L)，自由基清除能力表示1 g样品中Trolox的当量(μmol Trolox equivalents(TE)/g)。

(6)

式中：s为100 μL Trolox溶液+稀释后的3.8 mL ABTS+·工作液；sb为100 μL Trolox溶液加 3.8 mL乙醇；c为稀释后的3.8 mL ABTS+·工作液；cb为3.8 mL乙醇。

2.4.4 还原能力测定(RP)[19-21]

分别吸取1 mL多酚粗提液加入2.5 mL磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 mL K3Fe(CN)6(10 g/L)溶液，充分混合后于50 ℃下反应20 min；加入10% TCA溶液，于4 000 g 离心10 min；取上清，加入2.5 mL去离子水和1 g/L FeCl3溶液，于700 nm测定吸光度，并根据标准曲线计算还原力。利用抗坏血酸绘制标准方程为：

y=0.080 1x+0.157 9(R2=0.991 6)

(7)

式中：y为吸光度、x为抗坏血酸浓度(μmol/L)。还原能力表示每g样品中抗坏血酸的当量(μmol ascorbic acid equivalents(AAE)/g)。

2.4.5 过氧化氢(H2O2)清除能力测定[19-21]

分别取待测液0.6 mL，加入H2O2，然后加入45 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.4)，然后置于暗处在30 ℃下反应40 min，于230 nm测定吸光度，并根据标准曲线计算过氧化氢清除能力。利用阿魏酸绘制标准曲线，标准方程：

y=47.338x+32.772(R2=0.998 4)

(8)

式中：y为H2O2清除能力，x为阿魏酸浓度(μmol/L)，自由基清除能力表示为1 g样品中阿魏酸当量(μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g)。

(9)

式中：s为样品中加入H2O2的磷酸缓冲溶液吸光度；sb为阿魏酸溶液中加入磷酸缓冲溶液的吸光度；c为含有H2O2的磷酸缓冲溶液的吸光度；cb为磷酸缓冲溶液的吸光度(调零)。

2.5统计分析

所有数据重复3次，采用SPSS 22.0软件通过Tukey方法进行ANOVA统计分析。测量数据均以(平均值±标准偏差)表示。

3 结果与分析

3.1多酚含量的测定

由表1可以看出，6种水果中，总多酚含量最高的是香椿果，达到(91.85±7.48) μmol FAE/g，总多酚含量最低的是粗梗稠李，达到(0.49±0.016) μmol FAE/g。鸡嗉子果中可溶性多酚含量达(60.28±7.98) μmol FAE/g，与青刺果、多依果、蛇皮果和粗梗稠李均存在差异显著(p<0.05)；香椿果中键合多酚含量达(35.69±1.29) μmol FAE/g，与其他5种水果均存在差异显著(p<0.05)。

除多依果外，其他5种水果中可溶性多酚和键合多酚均呈现差异显著(p<0.05)，其中青刺果、鸡嗉子果和香椿果中可溶性多酚含量大于键合多酚，蛇皮果和粗梗稠李中可溶性多酚含量小于键合多酚。

表1 6种水果中的多酚含量 单位：μmol FAE/g

注：表1中每行不同字母表示差异显著(p<0.05)，每列不同数字表示差异显著(p<0.05)。表2同。

3.2DPPH自由基清除能力

由表2可见，在6种水果中，多依果中可溶性多酚对DPPH自由基清除能力最强，达到(39.65±2.49) μmol FAE/g，与其他5种水果均存在差异显著(p<0.05)，蛇皮果中键合多酚对DPPH自由基清除能力最强，达到(31.92±2.44) μmol FAE/g，与其他水果均存在差异显著(p<0.05)。除香椿果外，其他5种水果中可溶性多酚和键合多酚对DPPH自由基清除能力均呈现差异显著(p<0.05)，其中多依果、粗梗稠李和鸡嗉子果中可溶性多酚对DPPH自由基清除能力大于键合多酚，青刺果和蛇皮果中可溶性多酚对DPPH自由基清除能力小于键合多酚。

表2 6种水果中多酚抗氧化能力

3.3铁离子还原/抗氧化能力

6种水果中，青刺果中可溶性多酚对Fe3+还原能力最强(表2)，达到(135.51±16.10) mmol Fe2+/g，与其他5种水果均存在显著差异(p<0.05)，多依果中键合多酚对Fe3+还原能力最强，达到(28.09±1.84) mmol FE/g，与其他水果均呈现显著差异(p<0.05)。除粗梗稠李外，5种水果中可溶性和键合多酚对Fe3+还原能力均呈现显著差异(p<0.05)，其中青刺果、多依果、蛇皮果和鸡嗉子果中可溶性多酚对Fe3+还原能力大于键合多酚，香椿果可溶性多酚对Fe3+还原能力小于键合多酚。

3.4总抗氧化能力

6种水果中，多依果中可溶性多酚的总抗氧化能力最强(表2)，达(1 054.64±85.76) μmol TE/g，与其他5种水果均存在差异显著(p<0.05)；香椿果中键合多酚的总抗氧化能力最强，可达(171.41±6.41) μmol TE/g。6种水果中可溶性和键合多酚均呈现差异显著，且可溶性多酚的总抗氧化能力显著大于键合多酚(p<0.05)。

3.5还原能力

6种水果中，鸡嗉子果的可溶性多酚的还原能力最强(表2)，达(147.20±9.93) μmol AAE/g，与其他5种水果均存在差异显著(p<0.05)；香椿果中键合多酚对RP还原能力最强，可达(122.50±9.45) μmol AAE/g，与其他5种水果均存在显差异著(p<0.05)。除青刺果外，水果中可溶性和键合多酚的RP均有显差异著，其中多依果、粗梗稠李和鸡嗉子果中可溶性多酚的RP显著高于键合多酚，蛇皮果和香椿果的RP显著小于键合多酚。

3.6过氧化氢清除能力

6种水果中，粗梗稠李中可溶性多酚的过氧化氢清除能力最强(表2)，达(37.93±0.59) μmol FAE/g，与其他5种水果均存在差异显著(p<0.05)；香椿果中键合多酚的过氧化氢清除能力最强，达到(15.34±6.24) μmol FAE/g，与青刺果、多依果、蛇皮果和鸡嗉子果均存在差异显著(p<0.05)。除蛇皮果外，其他水果中可溶性和键合多酚的过氧化氢清除能力均呈现差异显著，其中青刺果、多依果、鸡嗉子果和粗梗稠李中可溶性多酚的过氧化氢清除能力显著大于键合多酚(p<0.05)，但香椿果中，键合多酚的过氧化氢清除能力显著大于可溶性多酚(p<0.05)。

4 结论

提取分离了多依果、蛇皮果、粗梗稠李、鸡嗉子果和香椿果中可溶性多酚和键合多酚，得到了可溶性多酚、键合多酚和总多酚的含量。香椿果中总多酚和键合多酚含量最高，分别达(91.85±7.48)和(35.69±1.29) μmol FAE/g，与其他5种水果均呈现差异显著(p<0.05)；除多依果外，其他5种水果中可溶性多酚和键合多酚均呈现差异显著(p<0.05)。

利用5种体外抗氧化活性测定体系对6种水果中多酚化合物进行了抗氧化活性测定，发现6种水果均具有较高的抗氧化活性。香椿果中键合多酚的还原能力、总抗氧化能力和过氧化氢清除能力最高，多依果中键合多酚的铁离子还原/抗氧化能力最强，蛇皮果中键合多酚的DPPH自由基清除能力最强。多依果中可溶性多酚的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力最强，青刺果中可溶性多酚的铁离子还原/抗氧化能力最强，鸡嗉子果中可溶性多酚的还原能力最强，粗梗稠李中可溶性多酚的过氧化氢清除能力最强。说明水果多酚的抗氧化能力与多酚含量、多酚种类和水果品种有一定的关系。

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ComparativestudyonthephenoliccontentsandantioxidantactivitiesoftypicalfruitsinYunnanprovince

LUO Heng-guo1, YANG Shi-hua2, LI Qing1, LUO Yu1, HUANG Yong-hua1, CHU Ya-jie3, LI Chun4, LI Yong-qiang1*

1(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China) 2(College of Foreign Languages, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China) 3(Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Dali 671003, China) 4(Yongping County’s Food and Drug Testing Institute, Yongping 672600, China)

The total phenolic contents and antioxidant activities of soluble polyphenol and insoluble bound polyphenol were determined in order to compare the differences among 6 kinds of selected fruits. The total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method, the antioxidant activities were evaluated by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, ferric reducing antioxidant power(FRAP), trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), reducing power (RP) and hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activityinvitro. Results showed that total polyphenol and insoluble bound polyphenol contents oftoonasinensiswere the highest (respectively 91.85±7.48 and 35.69±1.29 μmol FAE/g); the two fractions were significantly higher than others (p<0.05). Soluble polyphenol contents were the highest inDendrobenthamiacapitata( 60.28±7.98 μmol FAE/g), and was significantly higher than others (p<0.05).The reducing power (RP), hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity and trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) of insoluble bound polyphenols inToonasinensiswere the highest, the trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) and DPPH radical scavenging activity of soluble polyphenols ofDocyniadelavayiwere higher among 6 fruits. The results showed that the antioxidant capacity of polyphenol may be related to the variety of fruit, polyphenol content and phenolic compounds.

Yunnan province; characteristic fruits; polyphenol; contents; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014045

硕士研究生(李永强副教授为通讯作者，E-mail：liyongqiang7512@163.com)。

国家自然科学基金面上项目(31360378；31560428)；云南省自然科学基金项目(2013FB042)；云南省高校食品加工与安全控制重点实验室项目(201401)；云南省教育厅大学生创新创业训练计划项目(2016106760032；2016106760033)

2017-02-13，改回日期：2017-03-14