荧光定量PCR法计数农家干酪中动物双歧杆菌乳酸亚种

陈雪，刘韩，裴芳艺，刘振艳，侯惠玲，郭皓，丁琳，

杨文钦1，臧传刚1，刘宇超1，关宏1*

1(齐齐哈尔医学院 医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔，161006) 2(齐齐哈尔医学院，学院办公室，黑龙江 齐齐哈尔，161006)

荧光定量PCR法计数农家干酪中动物双歧杆菌乳酸亚种

陈雪1，刘韩2*，裴芳艺1，刘振艳1，侯惠玲1，郭皓1，丁琳1，

杨文钦1，臧传刚1，刘宇超1，关宏1*

1(齐齐哈尔医学院 医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔，161006) 2(齐齐哈尔医学院，学院办公室，黑龙江 齐齐哈尔，161006)

分别利用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数农家干酪中双歧杆菌的菌体数，通过对结果的比较分析，建立一种适用于快速、敏感、特异的检测干酪中双歧杆菌活菌数的方法。利用传统工艺制备双歧杆菌农家干酪，在其贮存期间分别采用荧光定量PCR及平板菌落计数法计数干酪中双歧杆菌的数量。其中，在利用荧光定量PCR法检测时，对影响PCR定量准确的因素进行系统研究，包括设计双歧杆菌引物，并对引物特异性进行评价、考察，从干酪基质中提取DNA的数量和质量，建立标准曲线。引物特异性验证结果表明，引物专一性强。采用试剂盒法从干酪样品中提取DNA的纯度较好，OD260/OD280均在1.75～1.82之间。除贮存第1天外，荧光定量PCR法计数结果比平板计数法高0.39%～2.25%，未见显著差异。荧光定量PCR具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于干酪中双歧杆菌的定量检测。

荧光定量PCR；干酪；双歧杆菌

双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，它作为维持人体肠道菌群平衡的有益菌[1]，被广泛应用于乳制品的制作中，如发酵乳、冰激凌、酸奶及干酪等[2]。不仅如此，它还具有提高机体免疫力[3]、降低结肠癌发病率、抗肿瘤、延缓衰老等一系列保健功能[4-6]，近年来备受人们青睐。与酸奶和发酵乳相比，干酪作为双歧杆菌等益生菌载体更具有优势：(1)干酪pH值相对较高，一般在pH 4.8～5.6之间，高于发酵乳的pH 3.7～4.3。(2)厌氧环境。干酪结构致密，内部氧化还原电位极低，其内部环境可以认为是厌氧环境，这有利于双歧杆菌类严格厌氧的益生菌生长。(3)缓冲力强。干酪结构致密且蛋白、脂肪含量高，这为益生菌通过胃肠道提供了保护作用[7-8]。

在益生菌食品中只有当益生菌保持一定活力且具有一定数量时才能发挥其益生作用。然而，市场上销售的益生菌产品通常会出现益生菌活菌数较低甚至不含益生菌等问题。事实表明，大多数菌株均具有非常相似的表型特性，利用传统平板培养法计数时不仅费时且选择性差，只能计数能够生长的菌株而对处于活的非可培养状态的细菌无法检测。此外，在混合发酵体系中，当其他菌株数量占优势且也能在相同的培养基生长时也无法用平板法检测其益生菌数[9]。因此，需要建立一种有效和快速的方法来鉴别益生菌同时计数活菌数[10]。实时荧光定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，在体系中加入荧光基团(通常为荧光染料或探针)，实时通过荧光信号的积累监测PCR的进程[11]。该方法以菌体DNA为模板，通过标准曲线来确定菌株在样品中的数量，具有敏感性高、特异性强、省时等优点，近年来该方法广泛应用于发酵乳制品中益生菌和致病菌的检测。

本研究以实验室保藏的动物双歧杆菌乳酸亚种QYW-BB06为研究对象，将其作为附属发酵剂添加到农家干酪中。在干酪贮存的20天内，每隔5天利用荧光定量PCR方法检测干酪中双歧杆菌的活菌数，并与传统平板计数方法作对比。同时，对影响PCR定量准确的因素：引物特异性、在干酪基质中提取DNA的数量和质量、标准曲线的建立进行系统研究，旨为建立一种准确、快速的测定农家干酪中双歧杆菌数量的方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌种

长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.longum)QYW-LB01，动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)QYW-BB06。以上菌种均保藏于齐齐哈尔医学院微生态工程技术研究中心。

1.1.2 培养基

(1)脱脂乳培养基：100 g/L 脱脂乳，10 g/L 酵母精；(2)改良MRS培养基：在MRS培养基中添加0.5 g/L的半胱氨酸[12]；(3)含莫匹罗星锂盐的MRS培养基：在改良MRS培养基中加入莫匹罗星锂盐50 mg/L；(4)M17培养基：购买于青岛海博生物有限公司。

1.2仪器与设备

Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega公司；SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa公司；ABI7300实时荧光 PCR 仪，ABI公司；梯度PCR仪、全自动荧光和化学发光成像分析系统，Bio-RAD公司；厌氧操作培养箱，SHEL LAB 公司；二氧化碳培养箱、Nano Drop紫外分光光度计，赛默飞公司。

1.3菌株复苏及DNA提取

将保藏的菌种分别以3区划线方式接种到固体改良MRS培养基中，37 ℃、厌氧培养48 h后用灭菌牙签挑取单菌落，分别接种到1 mL新鲜液体改良MRS培养基中，37 ℃、厌氧培养24 h。按5%的接种量继续扩培菌体，待菌体活力恢复后备用。

菌体DNA提取方法按照Wizard Genomic DNA Purification Kit的说明书步骤进行提取，将溶菌酶的浓度提高至50 mg/mL。取适量干酪发酵剂(含乳酸乳球菌)用M17培养基扩培菌体后直接提取DNA。

1.4绘制荧光定量PCR标准曲线

取经连续10倍稀释的已知量B.animalissubsp.lactisQYW-BB06DNA作为荧光定量PCR模板，以其已知量的不同菌数对数值为横坐标(lg CFU/g)，以反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标制作标准曲线。标准曲线方程：Y=-3.113x+39.121，斜率为-3.113，线性回归系数R2为0.995 95，PCR扩增效率E=101/3.113-1=1.095，即109.5%。通过测得的Ct值代入标准曲线方程中求出对应的菌数对数值，再反求其对数，计数样品中的双歧杆菌。

1.5引物设计及引物特异性验证

1.5.1 引物设计

动物双歧杆菌特异性引物的设计基于延伸因子tal基因的1个片段。引物序列及扩增产物长度如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物均用TE稀释制成100 μmol/L的贮存液。

表1 试验所用引物

1.5.2 PCR法对引物特异性的验证

采用PCR法，用双歧杆菌特异性引物扩增目的菌株DNA模板(B.animalissubsp.lactisQYW-BB06)及非目的菌株DNA模板(乳酸乳球菌)。PCR反应体系：模板DNA 1 μL，10×buffer 2 μL，dNTPS(2.5 mmol/L)1.6 μL，双歧杆菌上下游引物(10 μmol /L)各0.4 μL，r-Taq(5v/μL)0.4 μL，灭菌双蒸水补足至20 μL，设置3个平行样品。反应条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞，横线处共20个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5.3 荧光定量PCR法对引物特异性的验证[9]

采用荧光定量PCR法，用双歧杆菌特异性引物分别扩增目的菌株DNA模板(B.animalissubsp.lactisQYW-BB06)及非目的菌株DNA模板(乳酸乳球菌、B.longumsubsp.longumQYW-LB01)。在反应体系中，各菌株DNA模板量为50 ng。

将目的菌株DNA与非目的菌株DNA混合，且在非目的菌株DNA浓度较高的体系中验证引物的特异性。目的菌株DNA与非目的菌株DNA浓度比设置为1∶1、1∶50、1∶150及1∶1 000。

荧光定量PCR体系及反应条件：荧光定量PCR反应体系：SYBR premix ExTaq10 μL、正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL、ROX reference dye 0.4 μL、DNA模板2 μL及灭菌双蒸水6.8 μL补足至20 μL，每个DNA模板设置3个复孔。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，横线处共40个循环。

1.6农家干酪样品

样品制作工艺流程：鲜牛乳→过滤、杀菌(63 ℃，30 min)→冷却(32 ℃)→接种动物双歧杆菌乳酸亚种(108CFU/mL接种)→接种商业直投式发酵剂(包含乳酸乳球菌乳酸亚种及乳酸乳球菌乳脂亚种)→添加氯化钙(0.1 g/L)→添加凝乳酶→凝乳→切割凝块→静置→热烫→排乳清→水洗→堆积→盐渍→包装，4 ℃贮存。

1.7计数干酪样品中的双歧杆菌

在干酪贮存的第1、5、10、15、20天时分别使用平板菌落计数法及荧光定量PCR法计数干酪中双歧杆菌菌体数。

1.7.1 从干酪样品中取样

无菌条件下称取10 g干酪样品与90 mL灭菌的2%柠檬酸三钠-4%聚乙二醇8 000混合，室温下放置10 min，匀浆5 min。取1 mL混合溶液，使用含莫匹罗星锂盐的MRS培养基，倾注法进行平板菌落计数；另取1 mL混合溶液提取DNA。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取干酪样品中DNA，具体操作参照ABDULAMIR等人的方法[14]。利用紫外分光光度法分析DNA的浓度及纯度。DNA纯度的表达方式为OD260与OD280的比值。

1.8统计学分析

应用SPSS17.0软件中的方差分析对试验数据进行差异显著性分析，当p<0.05为差异显著；当p< 0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1PCR法对引物特异性的验证结果

选取干酪发酵剂中乳酸乳球菌为非目的模板进行引物特异性验证。分别以B.animalissubsp.lactisQYW-BB06DNA、乳酸乳球菌DNA、二者以不同比例混合的DNA为模板，以动物双歧杆菌引物进行PCR反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图1所示：泳道1、3、4均在100 bp偏上处有1条清晰条带，与扩增片段大小相符，为116 bp。泳道2为非特异性扩增，没有扩增条带，说明动物双歧杆菌引物不能扩增乳酸乳球菌DNA。泳道3、4为目的DNA与非目的DNA以不同比例混合为模板，均只有一条清晰条带且大小与特异性扩增(泳道1)相同。说明引物特异性强，在混合模板条件下未发生非特异性扩增。

M-DNA marker; 1-动物双歧杆菌DNA(目的菌株DNA); 2-乳酸乳球菌DNA(非目的菌株DNA);3-1 ng目的菌株DNA与 1 ng非目的菌株DNA混合;4-1 ng目的菌株DNA 与 50 ng非目的菌株DNA混合;5-水图1 PCR法对引物特异性的验证结果Fig.1 Verification of primer specificity by PCR

2.2荧光定量PCR方法对引物特异性的验证结果

采用荧光定量PCR方法对引物特异性进行验证，选取乳酸乳球菌、B.longumsubsp.longumQYW-LB01 DNA为阴性对照。结果见表2，动物双歧杆菌引物扩增非目的模板得到的Ct值为29.99和无计算结果(noCt)。动物双歧杆菌引物扩增目的模板得到的Ct值为14.73。

表2 荧光定量PCR检测引物特异性

注：1. 在反应体系中，各菌株DNA模板量为50 ng；2. 加粗的Ct值为目的菌株DNA。

在复杂的微生物体系中，荧光定量PCR扩增的目的模板不一定是数量占优势的菌属，因此有必要在目的DNA和非目的DNA混合体系中验证引物的特异性。在含有大量非目的DNA存在的条件下，动物双歧杆菌引物扩增目的DNA时所得的Ct值差异不明显(表3)。在目的DNA与乳酸乳球菌DNA混合体系中，所有按不同比例混合的模板所得的Ct值差异不显著，Ct值的变化(ΔCt)仅从0.01到0.19。在目的DNA与B.longumsubsp.longumQYW-LB01 DNA混合体系中，仅在比例为1∶1 000的体系中ΔCt值较大为1.17，其余按不同比例混合的模板ΔCt值仅从0.02到0.10。说明在含有这2种非目的模板存在的条件下，动物双歧杆菌引物能够特异性扩增目的模板。

表3 荧光定量PCR检测引物特异性

注：无非目的DNA模板混合的阳性对照用加粗的Ct值表示；1.a)1 ng 目的 DNA 与 1 ng 非目的DNA 混合；2.b)1 ng目的DNA 与 50 ng 非目的DNA混合；3.c)1 ng 目的 DNA与150 ng非目的DNA混合；4.d)1 ng目的DNA与 1 000 ng非目的DNA混合。

2.3从干酪样品中提取DNA

从干酪样品中提取DNA的数量和质量直接影响定量的准确性，所以选择一种合适的DNA提取方法显得尤为重要。从干酪样品中提取DNA的浓度及纯度结果见表4。结果显示，从干酪样品中提取DNA的纯度较高，OD260/OD280值均在1.75～1.82之间。DNA的质量浓度变化较大从16.4～24.6 ng/μL不等。干酪贮存第1天时所提取的DNA量最少，随贮存时间的延长，提取DNA的量逐渐增多。

表4 干酪贮存期间提取DNA的纯度、浓度检测结果

2.4荧光定量PCR法与平板计数法计数干酪中双歧杆菌

农家干酪是一种典型的非成熟、新鲜软质干酪。由于其货架期短,所以选择1、5、10、15、20天进行双歧杆菌的检测。分别提取1、5、10、15、20天的干酪样品DNA(表4)，用于荧光定量PCR的检测。图3所示，荧光定量检测与传统平板菌落计数法检测结果差异不显著(p>0.05)。除干酪贮存的第1天外，荧光定量方法检测双歧杆菌活菌数均高于平板计数方法，这可能与在贮存第1天从干酪中提取DNA数量较少有关。在贮存期内，干酪样品中B.animalissubsp.lactisQYW-BB06的活菌数均大于108CFU/mL。

图3 荧光定量PCR法与平板计数法计数干酪中双歧杆菌Fig.3 Comparison of Bifidobacterium animalis subsp. lactis count (lg CFU/mL) obtained by real-time PCR and plate count

3 讨论

采用平板计数法和荧光定量PCR法分别计数干酪中B.animalissubsp.lactisQYW-BB06数量。在干酪的贮存期内，采用平板计数方法计数双歧杆菌的活菌数时，活菌数在8.0～8.3 lg CFU/mL内变化。采用荧光定量PCR法计数的双歧杆菌数时，在干酪贮存的第1天，菌数(8.2 lg CFU/mL)量略低于平板计数法(8.3 log CFU/mL)，这可能与提取DNA数量较少有关；在贮存的第5、10、15、20天，荧光定量PCR计数的双歧杆菌数量(8.1～8.3 lg CFU/mL)均高于平板计数法(8.0～8.2 lg CFU/mL)。这是由于荧光定量PCR法是基于干酪样品中细菌DNA浓度和纯度进行计数的，而死菌、处于活的非可培养状态的DNA均可被提出，无法区分活菌及死菌，导致所有状态的菌体DNA一同被扩增，使结果偏高[15]。由此，可以看出所得DNA的浓度和纯度对荧光定量PCR计数的双歧杆菌数量影响较大。大多数乳制品中的DNA是从其制品内所包含的微生物提取得到的，乳制品中DNA的回收率应该是恒定的并且尽可能地高。LARPIN研究指出，干酪是一种“浓缩”的乳制品，营养成分丰富，蛋白质含量一般在20%～35%，脂肪含量通常≥25%，相当于将原料乳中的蛋白质和脂肪浓缩10倍，这种复杂的组成成分会直接导致DNA的提出率降低[16]。所以干酪在为益生菌提供良好保护作用的同时也为提取菌体DNA提高了难度。此外，复杂的乳制品成分中可能还含有PCR反应的抑制因子[17-19]。通常，从乳制品中提取DNA的第一步是将菌体细胞从乳制品中分离出来，这不仅简化了后续DNA的提取步骤，还消除了大多数与乳制品相关的反应抑制剂。目前，已有许多课题组对此方面进行研究，BARUZZI将干酪样品与柠檬酸钠溶液混合，用机械装置或玻璃珠匀浆使酪蛋白溶解[20]。FLREZ通过多次用缓冲液清洗菌体细胞，并添加Triton X-100或蛋白酶来去除酪蛋白[21]。STEVENS在均浆阶段加入聚乙二醇，更好地回收菌体[22]。CHRISTINE采用2%柠檬酸三钠-4%聚乙二醇8000缓冲液将菌体从干酪中分离出来后提取DNA，得到DNA的浓度较高且纯度OD260/OD280值均在1.80～2.11[10]。ABDULAMIR比较了4种从复杂基质中提取DNA的方法，以提取DNA的浓度和纯度为评价指标，得出采用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA质量最高[14]。通过综合比较分析，选用2%柠檬酸三钠-4%聚乙二醇8000缓冲液将菌体从干酪样品种分离出来，然后利用Wizard试剂盒提取其DNA，获得DNA纯度较高，OD260/OD280值均在1.75～1.82。DNA的质量浓度变化从16.4～23.4 ng/μL。

研究发现，叠氮类染料(叠氮溴化丙锭PMA，叠氮溴化乙锭EMA)可以抑制非活性菌体DNA的PCR扩增，这可进一步降低荧光定量PCR法计数时出现的假阳性结果[23-24]。ÉMILIE[13]在使用荧光定量PCR方法检测干酪在制作和成熟期间双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌和瑞士乳杆菌的活菌数时，使用PMA处理从样品中提取的DNA。结果表明，PMA可以抑制死菌的DNA扩增，这是由于PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联，抑制该DNA的PCR扩增。但必须指出的是本法虽然可以抑制死菌DNA的扩增，但无法去除全部已灭活的细胞对该试验产生的影响，这是由于已经灭活的细菌仍可能具有完整的细胞膜结构，而叠氮类染料是以细胞膜完整性作为细菌活性的检测标准。因此，叠氮类核酸染料检测法对不同细菌灭活方式的适用性还有待研究。应当指出，研究使用的两种计数法得出的结果差异不显著(p>0.05)。前期研究结果表明，B.animalissubsp.lactisQYW-BB06具有很强的耐酸、耐胆盐性，这为其在干酪中大量存活提供前提条件[25]。在20天的贮存期内，双歧杆菌活菌数仅微量降低，活菌数远大于死菌数。这可能是本文未使用叠氮类核酸染料处理提取的DNA，所用两种计数方法得出的结果仍差异不显著的原因。

本研究使用的荧光基团是非特异性的SYBR Green荧光染料，它具有使用方便不必设计复杂探针、反应灵敏价格便宜等优点。但主要的缺点就是容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性的结果。因此，为了减少假阳性结果的出现，就必须尽可能提高引物特异性。干酪是一种典型的多菌种发酵的产物，其发酵剂通常包括2种乳酸乳球菌。所以，在试验中应用的引物要求只能扩增出目的DNA(B.animalissubsp.lactisQYW-BB06DNA)，而不能扩增非目的DNA。SHEU[26]基于tuf基因分别为动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、两歧双歧、短双歧、婴儿双歧和长双歧杆菌设计了引物。在荧光定量PCR反应中，每一个目的DNA与其对应的引物都扩增出与预期大小相等的目的片段，且溶解曲线只有单峰。同时，将每一种引物与其非目的菌株DNA混合均得出阴性结果。在CHRISTINE[10]的研究中，给出了更加具体的引物特异性验证方法。将各菌株引物分别扩增目的菌株DNA(阳性对照)和非目的菌株DNA(阴性对照)或将目的菌株DNA与非目的菌株DNA按不同比例混合，观察Ct值变化。结果表明，设计的引物特异性强，对目的DNA进行扩增而非目的DNA不扩增。本研究使用的引物参考ÉMILIE[13]等人的研究，通过普通PCR及荧光定量PCR两种方法进行特异性验证。结果表明该引物特异性强，对干酪发酵剂中的乳球菌不扩增(无条带、无Ct值)；当扩增与目的菌株同源性较近的长双歧杆菌长亚种DNA时，所得Ct>29且Tm与目的菌株不同。当目的菌株DNA与大量非目的菌株DNA混合时，不影响目的菌株DNA的扩增，所得Ct差异不显著，这与CHRISTINE[10]的研究结果相似。

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AssessmentofBifidobacterialviabilityduringcheeseripeningbyreal-timePCRquantification

CHEN Xue1,LIU Han2*,PEI Fang-yi1,LIU Zhen-yan1,HOU Hui-ling1,GUO Hao1, DING Lin1,YANG Wen-qin1,ZANG Chuan-gang1,LIU Yu-chao1,GUAN Hong1*

1(Research Institute of Medicine and Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China) 2(Faculty Office,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China)

To establish a simple, sensitive, accurate and rapid detection method for bifidobacteria in cheese, we compared real-time PCR (qPCR) and plate counts.Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisQYW-BB06 (cfu) enumerated by qPCR were compared to culturableBifidobacteriumanimalissubsp.lactisenumerated by plate counts at 1, 5, 10, 15 and 20 days of cheese manufacture. The specificity of each primer set was assessed by qPCR and PCR, the yield and purity of DNA extracted from cheese were evaluated, and the standard curve was established. Target DNA was successfully amplified to show a single peak on the amplicon melting curve, non-target DNA was not amplified. High DNA yield and quality were obtained from cheese sample with mean OD260/OD280ratios ranging from 1.75 to 1.82. Besides of the first day of cheese storage, qPCR counts were higher than plate counts, values ranged from 0.39 to 2.25%. Real-Time PCR assay can be used in detection of bifidobacteria quantitatively in cheese.

real-time polymerase chain reaction; cheese;Bifidobacterium

硕士，助理研究员(关宏教授、刘韩工程师为通讯作者，E-mail:1352354944@qq.com，liuhan204@163.com )。

黑龙江省教育厅项目(产B族维生素乳酸菌的筛选及生物特性研究2016-KYYWF-0890)；齐齐哈尔市科技局项目(SFGG-201557)

2017-04-18，改回日期：2017-05-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014556