黄酒及其原料中微量氰化物的测定

邹伟,王栋,徐岩

(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江南大学生物工程学院酿造微生物及应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)

黄酒及其原料中微量氰化物的测定

邹伟,王栋*,徐岩

(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江南大学生物工程学院酿造微生物及应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)

基于氰化物衍生化及LC-MS/MS联用技术，建立了适用于黄酒及其原料中游离态氰化物及总氰化物测定的方法，该方法具有良好的准确度、精密度和灵敏度，检出限为0.01 μg/L，相对标准偏差低于5%，回收率在93.6%～106.0%。利用该方法对不同黄酒及其酿造原料中的游离态和总氰化物的含量进行了分析检测。结果表明，黄酒酿造原料大米和麦曲及黄酒中均含有微量氰化物。其中，麦曲氰化物含量相对较高，其游离态氰化物含量20.35～93.73 μg/L，总氰含量98.09～1 032.03 μg/L。黄酒中游离态氰化物的含量低于15 μg/L，总氰含量一般低于30 μg/L，表明在黄酒储存和销售过程中，氰化物可能不是影响黄酒氨基甲酸乙酯(EC)增加的主要因素。该研究结果为进一步明确黄酒中氰化物与EC的关系提供了技术手段和研究基础。

黄酒；麦曲；氰化物；检测

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)广泛存在于发酵食品和饮料酒中，如葡萄酒、黄酒、蒸馏酒、酱油等[1]。由于其具有潜在的危害性，近年受到越来越多的重视。2007年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将EC定义为2A类致癌物质[2]。黄酒中EC含量较高[3]。控制EC的含量对于黄酒产业的发展至关重要。

饮料酒中EC的形成一般认为有2种途径。在葡萄酒和清酒等发酵酒中，EC的形成主要由前体物质尿素及瓜氨酸等氨甲酰化合物与乙醇反应生成[4]。尿素等前体物质主要来源于酵母代谢和原料[5-7]。而在蒸馏酒中，包括中国白酒[8]、威士忌、白兰地、利口酒等[9-10]，EC主要由氰化物(cyanide，CN)与乙醇反应生成，而且氰化物转化生成EC的速率相对较快[11]。氰化物作为EC形成的重要前体物质，主要来自于酿酒原料中的生氰糖苷(cyanogenic glycoside)。世界上有超过2 000种植物含有生氰糖苷[12]，它们经β-葡萄糖苷水解酶或者高温酸解释放出氰化物[13]。由于黄酒酿造原料中存在生氰糖苷[14-15]，黄酒中的EC除了主要由尿素形成外，酿造过程中氰化物的释放也可能会增加EC的含量，目前尚未有明确的研究报道。

氰化物可分为游离态氰化物和结合态氰化物(如生氰糖苷)[16]。对于饮料酒中氰化物的测定较多针对蒸馏酒领域，常见的测定方法包括比色法、气相色谱-氮磷检测法(gas chromatography-nitrogen phosphorus detector,GC-NPD)、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrography,GC-MS)等[17-19]。国内外现行的蒸馏酒中氰化物测定方法是欧盟[20]及GB 5009.36—2016推荐的异烟酸-吡唑啉酮比色法[21]。但该方法定量限较高(0.015 mg/L)，易出现颜色干扰，难以满足酿造酒中微量氰化物测定的要求。由于氰化物是一种对人体具有严重毒害作用的物质[22]，为满足对氰化物准确定量的需要，近年来一些微量氰化物测定方法已用于血液[23]、环境[17]等样品的检测，但用于酿造酒中则少见报道。本研究基于氰根离子与2,3-萘基二缩醛(NDA)和牛磺酸易于发生衍生化反应生成一种苯环衍生物(N-substituted 1-cyanobenzoisoindole，CBI)的原理[24]，利用氰化物柱前衍生和液相色谱-二级质谱连用(liquid chromatography-mass spectrography/mass spectrography，LC-MS/MS)联用，建立了黄酒及其原料中微量氰化物的测定方法。

1 材料和方法

1.1材料与试剂

1.1.1 实验材料

麦曲、大米等黄酒酿造原料由浙江、江苏等地黄酒酿造工厂提供，黄酒样品为市售商品。

1.1.2 实验试剂

乙腈，甲醇，磷酸：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；无水乙醇，2,3-萘基二缩醛(NDA)，C13N15-氰化钾：色谱纯，上海百灵威；乙酸铵，牛磺酸：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；氨水，硫酸，酒石酸，乙酸锌，氢氧化钠，氰化钾：分析纯，上海国药集团。

1.2实验仪器

Xevo TQ三重四级杆液质联用仪(LC-MS/MS)、C18色谱柱(Acquity UPLC BEH 100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，美国Waters公司；Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司。

1.3实验方法

1.3.1 黄酒样品预处理

游离态氰化物预处理方法：参考文献[24]的方法。在20 mL的顶空瓶中加入2 mL的黄酒样品和10 μL质量浓度为1 mg/L的内标C13N15-氰化钾标准品溶液，顶空瓶内放入1个装有40 μL衍生剂(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二缩醛(NDA)溶液、50 mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水体积比为25∶25∶45∶5的混合溶液)的1.5 mL的离心管。沿壁添加2 mL浓硫酸后立即密封顶空瓶。室温下振荡30 min，得到衍生后产物，进样检测游离氰化物含量。

总氰化物预处理：按参考文献[21]的预处理方法。量取25 mL酒样于250 mL蒸馏瓶中，加入100 mL超纯水，将冷凝管下端插入盛有10 mL衍生剂(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二缩醛(NDA)溶液、50 mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水体积比为25∶25∶45∶5的混合溶液)比色管的液面下。加入1～2 g酒石酸，迅速连蒸馏装置进行水蒸气蒸馏，收集蒸馏液约50 mL，然后用甲醇定容至50 mL，混合均匀，加入内标进行取样检测。

1.3.2 固体样品预处理

游离态氰化物预处理方法：参照文献[25]的方法。使用磷酸/25%乙醇溶液提取固体样品中的氰化物，然后将提取液按照与1.3.1中黄酒游离态氰化物相同的方法进行处理。

总氰化物预处理方法：参照文献[21]的方法。称取20 g试样于500 mL水蒸气蒸馏装置中，加水约200 mL，塞严瓶口，在室温下放置2 h，然后加入20 mL乙酸锌溶液和2.0 g酒石酸，迅速连接好装置，将冷凝管下端插入盛有10 mL衍生剂(2.71 mmol/L用甲醇溶解的2,3-萘基二缩醛(NDA)溶液、50 mmol/L的牛磺酸溶液、甲醛和氨水体积比为25∶25∶45∶5的混合溶液)比色管的液面下。收集蒸馏液约50 mL，然后用甲醇定容至50 mL，混合均匀，加入内标进行取样检测。

1.3.3 样品检测

报道的检测条件[24]，在本实验条件下，主要对色谱分析中的流动相及洗脱程序和质谱检测条件碰撞能量等进行了优化。从3种流动相(乙酸铵、乙腈；乙酸铵、甲醇；水、乙腈)中确定2 mmol/L乙酸铵和乙腈作为流动相，响应值最高；通过调整洗脱程序得到较好的峰形。优化后的具体条件如下。

色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC BEH，100 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱温40 ℃；进样量2 μL；流动相：A为2 mmol/L乙酸铵，B为乙腈，流速0.3 mL/min；流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表1 流动相洗脱梯度

质谱条件：电离方式ESI(-)；多反应检测扫描质谱模式；离子源温度为150 ℃；碰撞能量30 eV；锥孔电压25 V；毛细管压力2 500 V。

1.3.4 标准曲线

将10 mg/L氰化钾标准品储备液稀释成一系列质量浓度的标准液，取上述溶液各2 mL，按照与样品相同的方法加入顶空瓶中进行衍生化处理。衍生物经LC-MS/MS检测，将所测得的峰面积与同位素峰面积的比值作为纵坐标，氰化物CN质量浓度为横坐标进行线性回归分析，得到标准曲线方程(y=0.023 05x+0.116 16，R2=0.991 34)。

2 结果与分析

2.1氰化物测定方法的建立与评价

2.1.1 目标物定性分析

按照1.3.1的操作步骤对氰化物标准品和黄酒样品进行衍生化操作，在优化的检测条件下氰化物衍生物及其同位素衍生物的质谱图如图1所示，衍生后的产物CBI分子量为300，在设定的质谱条件下，负离子模式分别选择离子对m/z299→191、m/z301→193和m/z299→81、m/z301→81作为定量离子对和定性离子对。

图1 氰化物衍生物质谱图Fig.1 Mass spectrum of CBI

按照1.3.3中的检测条件，对氰化物标准品和黄酒酒样进行分析，得到色谱图结果如图2所示。在本检测条件下，衍生后的产物保留时间为2.21 min。且在MRM(Multi Reaction Monitoring，多反应检测扫描)模式下，黄酒酒样和标准品的衍生后产物峰形良好，无干扰。

2.1.2 方法的精密度

为评估衍生化及LC-MS/MS联用测定黄酒及其原料中游离态和总氰化物方法的适用性，对该方法的

精确度、检测限、准确性等指标进行了考察。首先对10 μg/L的标准氰化钾溶液按照与样品相同的处理方法及测定条件进行日内和日间6次测定，结果如表2所示。测定结果表明，该测定方法较为稳定，相对标准偏差在2%～4%之间，精确度达到实验要求，具有较高重现性。

a-氰化钾标准溶液；b-黄酒图2 LC-MS/MS法测定氰化物衍生产物色谱图Fig.2 MRM chromatogram of CBI by LC-MS/MS

氰化物质量浓度/(μg·L-1)测定次数123456平均值/(μg·L-1)相对标准偏差/%日内10.2010.1610.409.8510.5010.2310.222.19日间10.4910.0410.2010.4110.619.5710.223.70

2.1.3 方法的检测限和定量限

根据检测限和定量限的常用计算方法[26]，当待测样品的信号与空白基质噪音的比值为3，即S/N=3时的浓度为氰化物测定的检测限；当待测样品信号与空白基质噪音的比值为10，即S/N=10时的浓度为氰化物测定的定量限。在本研究条件下，通过测定不同氰化物浓度样品，计算信噪比，可得氰化物测定的检测限和定量限分别为0.01 μg/L和0.05 μg/L。由于MS/MS的应用，使得微量氰化物测定的灵敏性得到了很大的提高[27]。与已报道的分析方法相比[22]，本方法具有更低的检测限。

2.1.4 乙醇含量的影响

由于黄酒是酒精饮料，为考察乙醇对该测定方法的影响，分别对乙醇体积分数不同(0、5%、10%、15%、20%)的10 μg/L氰化物CN溶液，按照与样品相同的处理方法及测定条件进行测定，结果如图3所示。不同乙醇体积分数对氰化物测定结果没有显著影响。因此，该方法可用于酒精饮料中氰化物的测定。

图3 乙醇含量对测定的影响Fig.3 Effect of ethanol on determination of cyanide

2.1.5 方法的准确性

在此基础上，进一步通过检测回收率分别考察了该方法对于黄酒中游离态氰化物和总氰化物(含结合态)测定的准确性。

在游离态氰化物质量浓度为4.71 μg/L的黄酒样品中，分别准确加入终浓度为2.5、10 μg/L的氰化物标准品，按照游离态氰化物测定的处理方法进行处理和分析，计算其回收率及相对标准偏差，结果如表3所示。添加不同质量浓度标准品的测定回收率分别为106.0%和93.6%，相对标准偏差为2.50%和5.61%，该方法对于黄酒中游离态氰化物的测定是准确的。

表3 游离态氰化物测定方法的准确度和回收率

在总氰化物质量浓度为24.0 μg/L的黄酒样品中，分别准确添加终质量浓度为500、1 000和2 000 μg/L的蜀黍糖苷(理论上可以转化生成41.6、83.2和166.4 μg/L的CN)，按照总氰化物测定的处理方法进行处理和分析，测定衍生化后的产物浓度，计算其回收率及相对标准偏差，结果如表4所示。结果表明，添加不同浓度结合态氰化物的测定平均回收率分别为89.9%、105.5%和89.7%，相对标准偏差也均在实验要求范围内。表明该方法对于黄酒中总氰化物(含结合态氰化物)的测定也是准确的。

表4 总氰化物测定方法的准确度和回收率

2.2黄酒不同酿造原料中氰化物的含量

利用上述氰化物测定方法，对不同来源用于黄酒酿造的大米、麦曲以及其他相关原料进行了游离态和总氰化物的测定，测定结果见表5。在所分析的黄酒酿造原料大米和麦曲中均含有微量的氰化物。其中大米中氰化物的含量较低，总氰化物含量在45 μg/kg以下，且主要是游离态氰化物，占总氰化物含量的54%以上。麦曲中游离态氰化物的含量为20.35～93.73 μg/kg，但总氰化物的含量相对较高，为98.09～1032.3 μg/kg，平均达到438.57 μg/kg。不同麦曲氰化物含量差异较大，而且麦曲中的氰化物主要以结合态为主，游离态氰化物所占比例较低。麦曲以小麦为主要原料，对小麦及其麸皮的氰化物含量测定结果表明，小麦中游离态氰化物的含量为15.32～42.05 μg/kg，总氰化物为63.02～168.95 μg/kg，而麸皮的氰化物含量相对较高，总氰化物的含量在96.94～828.77 μg/kg，说明小麦的总氰化物，特别是结合态氰化物，可能主要在麸皮中。黄酒酿造原料中，由小麦制得的麦曲中含有相对较高的总氰化物含量，在酿造过程中可能会分离出游离氰化物进而反应引起EC的增加，因此黄酒酿造对麦曲原料的选择可能需引起注意。相关研究还需进一步进行。

表5 酿酒原料中的氰化物含量

2.3黄酒中氰化物的含量

利用本研究建立的氰化物测定方法，进一步对市售的不同黄酒样品进行了测定分析，结果如表6所示。在所检测的黄酒样品中，均含有微量游离态氰化物，但含量低于15 μg/L，总氰化物绝大部分在30 μg/L以下。美国环保署和世界卫生组织对饮用水中氰化物的限量标准分别是200 μg/L[28]和70 μg/L[29]，黄酒中氰化物的含量远低于饮用水限量标准。由于黄酒产品中的氰化物含量较低，可以认为氰化物对于黄酒贮存过程中EC的增加没有显著影响。

表6 黄酒中氰化物的含量

3 结论

为考察氰化物对黄酒EC形成可能的影响，本研究基于氰化物衍生化及LC-MS/MS联用技术，建立了适用于黄酒及其原料中游离态氰化物及总氰化物测定的方法。该方法具有检测限低、准确度与精密度良好等特点，适用于黄酒中游离态氰化物及总氰化物的检测。利用该方法对不同黄酒及其酿造原料中的游离态和总氰化物含量的分析检测结果表明，黄酒及酿酒原料中存在微量氰化物。黄酒酿造主要原料大米的氰化物含量相对较低，麦曲中总氰化物含量较高，主要是结合态氰化物。而且不同麦曲氰化物含量差异较大，制曲时需要注意对小麦原料的选择。大量麦曲的使用可能会对黄酒酿造过程中EC的形成产生影响。黄酒中氰化物含量较低，对于黄酒贮存过程中EC的增加可能没有显著影响。研究结果为进一步明确黄酒中氰化物与EC的关系提供了技术手段和研究基础。

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DeterminationoftracecyanidesinChinesericewineanditsrawmaterials

ZOU Wei,WANG Dong*,XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education Synergetic Innovation Center for Food Safety and Nutrition Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A LC-MS/MS method coupled with cyanide derivatization was applied to the determination of free and total cyanide (CN) inHuangjiu(Chinese rice wine) and its raw materials. This method was precise, accurate and sensitive. Under the established conditions, the limit of detection LOD was 0.01 μg/L, the relative standard deviation RSD was less than 5% and the recovery was 93.6%-106.0%, respectively. Using this method, free and total cyanide were detected inHuangjiuand raw materials, and trace cyanides were found. A rather higher concentration of cyanides was detected in the raw material wheatQu, with a concentration range of 20.35-93.73 μg/L for the free cyanide and 98.09-1 032.03 μg/L for the total cyanide. Free cyanide and total cyanide inHuangjiuwere lower than 15 μg/L and 30 μg/L, respectively. This result suggested that cyanide might not be an important factor to increase the formation of ethyl carbamate during the storage and sale ofHuangjiu. This work provided an efficient analytical method and a basis for further studying the relationship between ethyl carbamate and cyanide inHuangjiu.

Huangjiu(Chinese rice wine); wheatQu; cyanide; determination

硕士研究生(王栋副教授为通讯作者，E-mail:dwang@jiangnan.edu.cn)。

国家重点研发计划项目(No.2016YFD0400503)；国家高技术研究发展计划(863计划，2013AA102108)；江苏省高校品牌特色专业建设工程(No.PPZY2015A056)

2017-03-03，改回日期：2017-05-03

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014209