香菇多糖树脂法脱蛋白质工艺研究

仲伟潭，宋盼，王崔岩，郭月玲，彭亮，常亮，张雪霞



香菇多糖树脂法脱蛋白质工艺研究

仲伟潭，宋盼，王崔岩，郭月玲，彭亮，常亮，张雪霞

050015 石家庄，华北制药集团新药研究开发有限责任公司/微生物药物国家工程研究中心/河北省工业微生物代谢工程技术研究中心

用树脂去除香菇多糖粗品中的蛋白质，纯化香菇多糖。以香菇多糖得率和蛋白质去除率为指标，比较 5 种不同种类树脂（D303、D315、HZ816、HZ801、FPA98）对香菇多糖粗品吸附的情况，并通过单因子试验与正交试验优化树脂去除香菇多糖中蛋白质的工艺参数。强碱性阴离子树脂 FPA98 吸附效果最好，在 pH 值为 9.0，上样质量浓度为 2 mg/ml，上样量为每毫升树脂20 mg，流速为 1 BV/h 的工艺条件下，香菇多糖提取液中的蛋白质去除率可达 70% 以上，多糖保留率为 80%以上。此工艺操作简单，环保，具有较好的实用性。

香菇多糖； 蛋白质； 树脂吸附法

香菇多糖是香菇中的重要生物活性成分，是一种-1,3-D 葡聚糖，20 世纪 60 年代，日本科学家证明其具有显著的免疫调节活性和抗肿瘤活性[1-2]。现代医学研究证明，香菇多糖还有抗感染、抗辐射、抗凝血等作用，硫酸化香菇多糖还具有显著抗 HIV 的作用，同时香菇多糖在治疗胃癌、结肠癌、肺癌等方面也有良好疗效，作为免疫辅助药物，香菇多糖在国际市场上得到推广应用[3]。

有关香菇多糖的分离纯化报道很多，在分离阶段大多采用有机试剂沉淀法[4-8]去除其中的蛋白质，但是存在一次除蛋白率低、有机相不易分离等缺点。本文通过实验，用大孔树脂去除香菇多糖粗粉中的蛋白质，一次除蛋白效率高、操作简单、环保，并避免了因采用酸或碱而对香菇多糖造成的破坏。

1 材料与方法

1.1 材料

TU-1901 紫外可见分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司产品；TDA-8002 型恒温水浴锅为天津市泰斯特仪器有限公司产品；旋转蒸发器 RE-52AA 型购自上海荣生化仪器厂；机械搅拌器购自上海司乐仪器有限公司；实验室 pH 计（FE20）购自梅特勒·托利多公司；真空减压浓缩罐 ZN200 型为常熟市天工医药化工设备有限公司产品。

香菇，购于本地市场；大孔吸附树脂、离子交换树脂为上海华震科技有限公司产品；考马斯亮蓝 G-250 和牛血清白蛋白均购自美国 Sigma 公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质去除率和多糖保留率的测定及计算方法 采用考马斯亮蓝 G-250 法，以牛血清蛋白为标准品[9]，线性回归方程为= 221.45– 12.013，相关系数= 0.9975，其中，为蛋白质质量浓度；为吸光度。

蛋白质去除率 =ρ前– ρ后× 100% ρ前

式中：前、后分别为上柱前和上柱后蛋白质质量浓度，单位为 μg/ml。

采用苯酚-硫酸法[10]测定香菇粗多糖去除蛋白质前后的多糖含量。

多糖保留率 =上柱后多糖含量× 100% 上柱前多糖含量

1.2.2 样品溶液的制备 10 kg 新鲜香菇粉碎后，按料液比 1:20（g/ml）加水，沸水浸提 3 h，离心，菇渣再沸水浸提 2 h 后离心，合并两次提取液。提取液用真空减压浓缩罐浓缩至 30 L 后，加乙醇至 75% 沉淀，过滤得香菇粗多糖湿品；湿品按 1:40 加水复溶，沸水浸提 3 h，过滤，滤液用真空减压浓缩罐浓缩至 10 L，加乙醇至 60% 沉淀，过滤，所得沉淀物 60 ℃真空干燥得到香菇粗多糖干品。将适量香菇粗多糖干品加水，100 ℃加热搅拌下溶解 2 h，过滤，滤液为样品溶液。

1.2.3 树脂的预处理 大孔吸附树脂先用 4 BV（BV：树脂柱床体积）5% HCl 溶液流动洗柱，洗完后浸泡 3 h以除去树脂中的无机杂质，用去离子水冲洗至中性；再用 4 BV 5% NaOH 溶液流动洗柱，洗完后浸泡 3 h以除去树脂中的有机杂质，用去离子水冲洗至中性。而后用工业乙醇浸泡 6 h，最后用蒸馏水洗至无醇味。

阴离子交换树脂先用 4% 的 NaOH 溶液浸泡 12 h，然后用去离子水洗至中性；再用 5% 的 HCl 溶液浸泡 12 h，然后用去离子水洗至中性。

1.2.4 树脂类型筛选 准确量取处理好的离子交换树脂 50 ml，湿法装入玻璃层析柱，将 2 mg/ml 的样品溶液 200 ml 以 1 BV/h 的流速流过树脂层析柱，收集流出液。上样完毕，关闭柱子下端活塞，接着用 2 BV 去离子水以 1 BV/h 的流速洗脱，再用 4 BV 8% NaCl 以 1 BV/h 的流速解吸，合并水洗脱液与上样收集的流出液，测定其蛋白质质量浓度和多糖含量，计算蛋白质去除率和多糖保留率。

1.2.5 单因素试验和正交试验 根据静态试验筛选出的树脂，以香菇粗多糖样品溶液的 pH 值、质量浓度、上样量和上样流速为单因素条件，测定并计算不同条件下的蛋白质去除率和多糖保留率，在单因素试验基础上设计正交试验，优化工艺条件。

2 结果

2.1 不同树脂对香菇粗多糖的蛋白质去除率和多糖保留率比较

通过 5 种不同种类树脂对香菇粗多糖的蛋白质去除率和多糖保留率比较（表 1），发现强碱性阴离子树脂 FPA98 去蛋白质效果较好，多糖保留率较高，适合香菇粗多糖的蛋白质去除纯化。

2.2 单因素试验

2.2.1 pH 值对树脂蛋白质去除率和多糖保留率的影响 将相同质量浓度的样品溶液调成 pH 为 4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0，分别取 200 ml 上到 50 ml FPA98 树脂柱，按照动态吸附操作方法操作，由图 1 可以看出，当 pH 为 4.0 ~ 8.0 范围时，树脂对香菇粗多糖溶液的蛋白质去除率随着 pH 值的升高明显升高，当 pH 为10.0 ~ 12.0，蛋白质去除率随 pH 升高而降低，多糖保留率也明显降低。从蛋白质去除率和多糖保留率综合考虑，pH 值应在 8.0 ~ 10.0 之间为宜。

2.2.2 样品溶液质量浓度对蛋白质去除的影响 将样品溶液质量浓度调成 1、2、3、4、5 mg/ml，pH 值为 9.5，分别取 200 ml 上到 50 ml PFA98 树脂柱，按照动态吸附操作方法操作，由图 2 可知，样品溶液质量浓度在 3 mg/ml 之前，蛋白质去除率和多糖保留率基本无变化，当料液质量浓度继续增大时，蛋白质去除率和多糖保留率均有所降低。实验过程中，当料液质量浓度到 5 mg/ml 时，料液太黏稠，无法顺利流过树脂柱。

表 1 5 种树脂的去除蛋白能力比较

百分率（%）Percentage (%)1009080706050403020100 4 6 8 10 12 pH

Figure 1 Effect of pH on protein removal rate and polysaccharide retention rate

百分率（%）Percentage (%)80 75 70 65 60 55 50 1 2 3 4 上样质量浓度（mg/ml）Sample concentration (mg/ml)

Figure 2 Effect of sample concentration on protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.2.3 上样量对蛋白质去除的影响 将一定质量浓度的样品溶液 pH 值调为 9.5，上到 50 ml PFA98 树脂柱，分段收集流出液，按照动态吸附操作方法操作，由图 3 可看出，随着上样量的增大，蛋白质去除率逐渐降低，多糖保留率有所上升，当上样量增大至每毫升树脂 30 mg 时，蛋白质去除率明显降低，因此，上样量以不超过每毫升树脂30 mg 为宜。

2.2.4 上样流速对蛋白质去除率的影响 将一定质量浓度的样品溶液 200 ml，pH 调为 9.5，上到 50 ml PFA98 树脂柱，上样流速分别为 0.5、1、1.5、2、2.5 BV/h，按照动态吸附操作方法操作，由图 4 可看出，随着上样体积的增加，蛋白质去除率逐渐降低。当流速为 1 BV/h 时，蛋白质去除率较高且降低缓慢，但是流速过慢，影响生产效率，延长生产周期；流速过高，蛋白质去除率下降太快。综合考虑，最佳上样流速为不超过 2 BV/h。

百分率（%）Percentage (%)90 80 70 60 50 10 20 30 40 50 上样量（mg）Sample loading amount (mg)

Figure 3 Effect of sample loading amount on protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.3 正交试验

根据单因素试验结果，按照 L9(34) 正交表设计正交试验（表 2），全面考察 4 个因素对树脂去除香菇粗多糖中蛋白质的影响，确定最佳工艺条件，结果见表 3。

由表 3 蛋白去除率极差分析可看出，pH 对于蛋白去除率的影响较大，上样量次之，上样质量浓度对蛋白质去除率影响最小。从数据分析确定的蛋白质最佳去除条件为 pH 9.0，上样质量浓度为1 mg/ml，上样量为每毫升树脂 10 mg，上样流速为 0.5 BV/h。

由表 3 多糖保留率极差分析可看出，pH 对于多糖保留率影响最大，上样质量浓度次之，上样量对多糖保留率影响最小。从数据分析确定的最佳多糖保留率条件为 pH 8.5，上样质量浓度为3 mg/ml，上样量为每毫升树脂 30 mg，上样流速为 1.5 BV/h。

百分率（%）Percentage (%)80 70 60 50 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 上样流速（BV/h）Flow rate (BV/h)

Figure 4 Effect of sample flow rate on protein removal rate and polysaccharide retention rate

表2 香菇粗多糖蛋白质去除正交试验因素及水平

表3 香菇多糖去蛋白正交试验设计与结果

综合考虑，最终确定 FPA98 树脂对香菇多糖粗品的最佳去蛋白工艺为 pH 9.0，上样质量浓度为 2 mg/ml，上样量为每毫升树脂 20 mg，上样流速为 1 BV/h。在此条件下进一步实验表明，香菇多糖的蛋白质去除率可达 70.53%，多糖保留率为 80.65%，优于正交组合表中各处理的结果，证明优化的条件是合理的。

3 讨论

采用大孔吸附树脂和离子交换树脂对香菇多糖粗粉进行脱蛋白，以蛋白去除率和多糖保留率为指标，筛选出强碱性阴离子树脂 FPA98 效果最好。通过单因素和正交试验对其进行优化，采用此工艺的最佳工艺条件为：pH 值为 9.0，上样质量浓度为2 mg/ml，上样量为每毫升树脂 20 mg，上样流速为 1 BV/h。蛋白质去除率可达 70% 以上，多糖保留率 80% 以上。

本研究采用树脂法去除香菇多糖中的蛋白质，与常规的多糖脱蛋白方法相比具有工序少、操作简单、溶剂安全、处理量大、周期短、不会破坏多糖的结构等优点。因此，采用树脂进行香菇多糖脱蛋白不仅为后续研究香菇多糖的分离纯化、结构与生物活性奠定了坚实的基础，也为研究其他植物原料经微生物发酵后提取的多糖进行蛋白质去除提供了重要技术参考。

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Study on removal of protein from lentinan by resin adsorption method

ZHONG Wei-tan, SONG Pan, WANG Cui-yan, GUO Yue-ling, PENG Liang, CHANG Liang, ZHANG Xue-xia

National Engineering Research Center of Microbial Medicine, Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center, New Drug Research & Development Company of NCPC, Shijiazhuang 050015, China

To remove the proteins from crude lentinan by resin adsorption method.Based on the index of lentinan yield and protein removal rate, 5 different kinds of resins (D303, D315, HZ816, HZ801 and FPA98) were compared to the adsorption of crude lentinan, and then the technological parameters of removing the protein from Lentinan were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment.Thestrong basic anion exchange resin FPA98 was selected as the best adsorbent. The protein removal rate could reach above 70% and the lentinan retention rate was above 80% under the optimal conditions such as pH 9.0, the sample mass concentration of 2 mg/ml, the sample loading amount with 20 mg per milliliter resin, and the flow rate of 1 BV/h.The process is simple, environmental friendly and practical.

Lentinan; Proteins; Resin adsorption method

ZHANG Xue-xia, Email:zhangxuexiazxx@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.006

张雪霞，Email：zhangxuexiazxx@163.com

2017-06-19