云南烤烟根际土壤PGPR菌株的筛选与鉴定

黄智华，崔永和，计思贵，苏友波，张立猛*

（1.云南省烟草公司玉溪市公司，烟草行业病虫害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201）

云南烤烟根际土壤PGPR菌株的筛选与鉴定

黄智华1，崔永和1，计思贵1，苏友波2，张立猛1*

（1.云南省烟草公司玉溪市公司，烟草行业病虫害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201）

为了利用本地PGPR菌株改善云南植烟土壤质量，提高磷、钾等元素利用率，促进烤烟生长，在云南主要植烟区采集烤烟根际土壤样品31个，对根际土壤中的微生物进行分离，筛选和鉴定，共获得解磷、解钾或促生菌共773株，进一步筛选获得到了10株具有较强解磷、解钾或IAA促生作用的菌株。经鉴定发现10个菌株分别属于Bacillus（芽孢杆菌属）、Paenibacillus（类芽孢杆菌属）、Providencia（普罗威登斯菌属）。筛选出的PGPR为微生物肥料的开发提供了优质的菌种资源，进一步研究将关注PGPR菌株的混配以及在土壤中的定殖。

烤烟；PGPR；解磷；解钾；IAA促生

PGPR（植物根际促生细菌）是一类自由生活在土壤或附生于植物根际的可以促进植物生长及矿质营养利用，并能抑制有害微生物的有益菌类。1978年BURR和SCHROTH首次报道了马铃薯上的PGPR[1]。PGPR可以固定空气中的氮气，溶解土壤中不能被植物直接吸收的磷素，释放硅酸盐矿物中的钾素，而且还可分泌植物生长调节物质，促进植物根系生长，增强植物抗病能力。PGPR用作生物肥料的菌种，持续性好，对非再生能源消耗少，对环境、食品安全，经济效益高，同时可以改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地，保持农牧业生产的可持续发展[2]。

PGPR肥料在小麦[3]、水稻[4]、玉米等农作物及蔬菜上的应用效果良好，在烤烟种植中也具有重要价值。王豹祥等[5]报道了施用PGPR菌肥能够适当减少化肥用量，并改善土壤微生物群落，提高烤烟抗病性。席淑雅等[6]研究发现烤烟根际促生菌用于烤烟漂浮育苗可明显提高种子发芽率、成苗素质和对烟草病害的抗性。吴秉奇等[7]研究发现从烤烟根际分离的拮抗菌诱导烟株产生系统抗性，增强对病害的防御力，并且能有效防治烟草黑胫病。为了充分研究本地PGPR资源，获得适用于本地土壤条件和烤烟种植的PGPR菌株，本研究在云南植烟区采集烤烟根际土壤，筛选鉴定根际土壤中PGPR菌种，为进一步应用PGPR菌提高烤烟品质提供优良的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 菌株筛选

1.2.1 样品采集 2015年4—5月在云南主要植烟区共采集烤烟根际土壤样品31个，其中玉溪市14个（红塔区3个、江川区2个、澄江县2个、新平县2个、峨山县2个、华宁县1个、元江2个），普洱市2个，昆明2个，曲靖4个，楚雄2个，大理5个，红河2个。于烤烟旺长期取样，连根带土采集烟株带回实验室。

1.2.2 根际土壤悬液的制备 小心去除烟株根系周围的土壤，切成1 cm左右的小段，取1 g于三角瓶中，加入9 mL灭菌水，静置20 min后150 r/min振荡30 min，即得土壤悬浮液。吸取1 mL土壤悬浮液接入装有9 mL无菌水试管中，用旋转振荡器充分振荡，依次制备得到 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，80 ℃水浴30 min。

1.2.3 培养基及参比菌 解无机磷培养基、蒙金娜基础培养基、解钾培养基、CRA培养基、LB培养基配制方法见参考文献[8-10]。在液体培养基成分中添加琼脂15.0～20.0 g/L制成相应的固体培养基。参比菌种分别为分离自德根贝中的解磷菌株、生物钾肥中的解钾菌株和金农肥中的IAA分泌菌株。

1.2.4 初步筛选 将土壤悬浮液分别涂布在3种选择性培养基平板上，置于恒温培养箱中 28 ℃培养3～5 d。待平板长出菌落后，分别根据是否显示解磷圈、菌落形态是否为油滴状和是否显示红色，挑选解磷、解钾和IAA分泌菌株，冷冻保存。

1.2.5 定性测试复筛 根据解磷圈的大小确定解磷能力，根据解钾圈的凸起大小确定解钾能力，根据菌落红色的深浅判断分泌IAA能力。

1.2.6 定量测试复筛 将纯化后的菌株接种至各培养基中，在28 ℃、150 r/min条件下培养至菌浓度约为 5×108/mL进行定量复筛。无机解磷菌：取10 mL细菌悬液，加入30 mL去离子水和1 mL H2O2，砂浴锅上加热至粘液消失。冷却后用定量滤纸进行过滤，并定容至100 mL。用钼锑抗比色法测磷含量。有机解磷菌：将细菌悬液转移至已灭菌的50 mL离心管中，超声波破碎细菌细胞（200 W，20 min），在4 ℃下以4000 r/min离心20 min，取上清液5 mL，用钼锑抗比色法测磷含量。解钾菌：取5 mL细菌悬液于50 mL小三角瓶中，加入3 mL 30% H2O2，放于砂浴锅上蒸煮并不断搅拌，0.5 h后再加入2 mL 30% H2O2，至硅酸盐细菌粘液消失时取下。过滤至50 mL容量瓶中并定容。利用火焰光度计测定菌液中的钾含量。IAA促生菌：将细菌悬液5000 r/min离心5 min，取上清液6 mL，加3 mL显色试剂，室温显色30 min后，于540 nm处测定IAA含量。

1.3 菌株鉴定

1.3.1 候选菌株DNA的提取和16s rDNA的序列扩增 采用CTAB/NaCl法分别对候选菌株进行DNA提取，并采用27F和1492R通用引物扩增16s rDNA。

1.3.2 16s rDNA序列测定和分析[11-13]PCR产物的纯化和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。将所得序列与NCBI GenBank中核酸数据进行BLAST分析，同源性比较及种属鉴定。应用MEGA软件进行多序列比对，采用Clustl W进行聚类分析。

1.3.3 形态观察 在LB培养基上进行菌株平板划线，28 ℃培养48 h后进行形态观察。

菌株样品经过固定，清洗，干燥，用导电胶粘在12 mm的观察台上，喷金后用Phenom电镜进行扫描电镜分析。

1.3.4 生理生化分析 生理生化试验参照伯杰氏细菌鉴定手册第九版[15]。

2 结 果

2.1 菌株筛选

2.1.1 初步筛选 在云南省主要植烟区分离得到烤烟根际具有解磷、解钾或促生作用的菌株共 773株，各地区分离菌株数量见表1。

表1 烤烟根际解磷、解钾或IAA促生菌筛选统计Table 1 Statistics of phosphate-solubilizing,potassium-solubilizing or IAA-producing bacteria screened rom flue-cured tobacco rhizosphere

2.1.2 复筛 通过定性和定量筛选，得到了 10株具有较强解磷、解钾或促生能力的菌株，各种菌株解磷、解钾、促生作用的测试结果见表2。

表2 10种菌株的解磷、解钾、IAA促生能力比较Table 2 Capacity of potassium-dissolving, phosphate solubilizing and IAA secreting of 10 strains

2.2 候选菌株的鉴定

选用细菌通用引物扩增细菌的16s rDNA区域，对复筛得到的菌株中解磷、解钾或IAA促生能力较强的10个菌株进行16s rDNA序列扩增（图1），凝胶中明亮的条带即16s rDNA。

图1 细菌 16s rDNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱（M：分子标记；1～10依次为：X4，X16，X56，X66，BK22，BK38，BK40，BK43，M3，CH65）Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the fragment from the 16s rDNA(M: Marker. 1 to 10: X4, X16, X56, X66, BK22,BK38, BK40, BK43, M3, CH65)

烟草根际分离得到的 10株细菌菌株经鉴定后发现，BK40为Providencia rettgeri（雷氏普罗威登斯菌），M3属于Paenibacillus（类芽孢杆菌属），其余 X4、X16、X56、X66、BK22、BK38、BK43、CH65均为 Bacillus（芽孢杆菌属），集中在Bacillusmegaterium（巨大芽孢杆菌）、Bacillus cereus（蜡状芽孢杆菌）、Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌）、Bacillus simplex （简单芽孢杆菌）、Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）和 Bacillus aryabhattai、Bacillus macroides几个细菌类群（表 3）。

2.3 典型菌株X16、BK38、M3鉴定

2.3.1 形态特征 各菌株的微观形态如图 2。菌株X16菌体杆状，1.0～1.2 μm×1.5～2 μm，圆形。在 LB培养基上菌落呈乳白色，表面凸起有光泽，边缘整齐，质地较粘。

菌株 BK38 菌体杆状，0.7～0.9 μm×3～4 μm，圆形。在LB培养基上菌落呈乳白色，表面凸起有光泽，边缘整齐，质地较粘。在LB平板需氧培养24 h，细菌生长旺盛，菌落光滑，湿润，半透明淡黄色菌落，有气味。

菌株 M3 菌体杆状，大小为 0.7～0.9 μm×3～4 μm，椭圆形。在LB培养基上菌落呈乳白色，表面凸起有光泽，边缘整齐，质地较粘。

图2 典型菌株的SEM分析Fig. 2 SEM analysis of representative strains obtained from tobacco soil

表 3 烤烟根际菌株16s rDNA序列比对结果Table 3 The comparsion results of bacterial sequences from the GenBank database with the highest similarity to the sequence of 16s rDNA of each indigenous bacteria isolated from tobacco

2.3.2 生化分析 对 X16、BK38和M3进行生化分析并与标准菌株的生化特性对比发现[14-16]，X16的生化特性与Bacillus megaterium相似，BK38的生化特性与Bacillus macroides相似[17]，M3的生化特性与Paenibacillus相似（表4）。

2.3.3 同源性分析 菌株X16、BK38和M3的16s rDNA测序结果经NCBI blast分析，结果显示分别与 Bacillus megaterium、Bacillus macroides和Paenibacillus同源性为95%、96%、95%，用MEGA5.1软件建立系统发育树如图3所示。

表4 菌株X16、BK38和M3的生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of X16、BK38 and M3 isolates

由系统发育树可知，同是芽孢杆菌属或其近缘属，但菌株BK38与芽孢杆菌属中Bacillus macroides的亲缘度更接近，菌株X16与芽孢杆菌属中的巨大芽孢杆菌亲缘度更接近，达到95%，且菌株BK38和菌株X16同属于一个亚种，亲缘度明显高于菌株M3；菌株M3与芽孢杆菌属中的多粘芽孢杆菌亲缘度更接近。结合形态学分析、生理生化分析和同源分析基本确认BK38为Bacillus macroides，X16和M3有待进一步确认。

3 讨 论

土壤质量下降和面源污染已是目前农业面临的主要问题[18]，其中一个主要的原因就是肥料过量施用。利用微生物肥料提高肥料利用率，降低肥料施用量是改善土壤质量，促进土壤可持续发展，解决农业面源污染的有效途径。微生物肥料在烤烟种植中的作用也受到广泛的关注[19-20]。获得优良的微生物菌种是开发微生物肥料的前提。

图3 以16s rDNA序列为基础的菌株X16、BK38、M3系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of X16、BK38 and M3 isolates based on 16s rDNA sequence

根际是植物根系与土壤界面数毫米范围内，根系、土壤、细菌、真菌、动物等共同作用形成的具有独特性能的微域环境，最早由德国科学家LORENZ HILTNER在1904年提出[21]。根际环境与植物根系相互作用强烈，具有根际效应。根际微生物数量远大于非根际土壤，在微生物结构和功能多样性等方面具有重要特性[22]。其中PGPR具有固氮、解磷、解钾、分泌抗生素和植物激素、拮抗病原物和促进植物生长等多种功能，是微生物开发的重要资源[23]。目前，国内外报道的 PGPR主要包括 27个属，其中以芽孢杆菌属 Bacillus和假单胞菌属Pseudomonas的种类最多[24]。与烟草相关的 PGPR主要有微杆菌属 Microbacterium、香味菌属Myroides、伯克霍尔德氏菌属Burkholderia、肠杆菌属 Enterobacter、泛菌属 Pantoea、克雷伯氏菌属Klebsiella、土壤杆菌属 Agrobacterium[25]、假单胞菌属 Pseudomonas[26]、芽孢杆菌属 Bacillus[27]。本研究中所鉴定的菌株中大部分属于Bacillus也符合这一特点。

本项目所筛选获得的PGPR菌株，分别具有解磷、解钾或IAA分泌功能，对各种菌株进行混配后，获得了同时具有解磷、解钾、分泌IAA功能的微生物菌肥，施入土壤后对烤烟生长具有显著的促进作用。PGPR能否在土壤中的定殖是PGPR菌肥能否发挥作用的关键。研究表明不同的土壤肥力条件对PGPR的定殖影响较大[28-30]，因此在后续研究中应针对筛选出的PGPR菌株配套合理的施肥措施。

4 结 论

本研究在云南主要植烟区采集的烤烟根际土壤中筛选获得了具有解磷、解钾或IAA促生功能的菌株共773株，并进一步筛选获得到了10株具有较强解磷、解钾或IAA促生作用的菌株。筛选获得的10株菌株有8株属于Bacillus（芽孢杆菌属），1株属于 Paenibacillus（类芽孢杆菌属），1株属于Providencia rettgeri（雷氏普罗威登斯菌）。结合菌种形态特征、生理生化特性和16s rDNA测序分析，基本确定菌株BK38为Bacillus macrolides。筛选出的PGPR菌株为进一步的混配和微生物肥料的开发提供了优质的菌种资源。

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Isolation and Identification of PGPR Strains from Rhizosphere Soil of Yunnan Flue-cured Tobacco

HUANG Zhihua1, CUI Yonghe1, JI Sigui1, SU Youbo2, ZHANG Limeng1*
(1. Yunnan Tobacco Company, Yuxi Branch, Biological Control for Tobacco Diseases and Insect Pests Engineering Research Center of China Tobacco, Yuxi, Yunnan 653100, China; 2. College of Resource and Environment, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

To improve the quality of tobacco-planting soil, the utilization rate of fertilizer and finally the quality of tobacco in Yunnan Province by local PGPR, rhizosphere soil samples were collected from the main tobacco-planting fields of Yunnan Province.Rhizosphere bacteria were isolated, screened and identified from soil samples. Capacity of potassium-dissolving, phosphate solubilizing and IAA secreting of bacteria were focused. Morphological observation, biochemical analysis and 16s rDNA sequencing were used to identify the species of PGPR candidates. In result, 31 samples of rhizosphere soil were collected from cities of Yuxi,Kunming, Qujing, Honghe, Chuxiong, Dali, and 773 strains of PGPR were isolated from these soil samples. Ten effective strains were obtained after further screening. The strains belongs to Bacillus, Paenibacillus and Providencia. This research provides resource of excellent PGPR strains for further development of microbial fertilizer. Further works will focus on the mixture and colonization research of these PGPR candidates.

flue-cured tobacco; PGPR; phosphorus-solubilizing; potassium-dissolving; IAA-secreting

S435.72

1007-5119（2017）05-0018-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.004

云南省烟草公司科技计划项目“烤烟根际解磷解钾促生菌PGPR的筛选及应用推广”（2012YN43），“密集种植烟区土壤保育及烟叶质量提升技术研究与应用”（2017YN17）

黄智华（1987-），男，农艺师，博士，主要从事烟草栽培方面研究。E-mail：huangzhihua0930@126.com。*通信作者，E-mail：zlm.d@163.com

2017-05-17

2017-09-11