Rcn3与细胞内质网应激机制的相关性

陈学正++王清华++杨东奇++马润林++石小倩

小鼠Reticulocalbin（RCN3）蛋白是一种定位于哺乳动物内质网分泌途径，含有6个EF-Hand结构域的内质网钙离子结合蛋白。为了研究Rcn3与内质网应激机制的相关性，我们利用前期获得的Rcn3基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞作为实验材料。将细胞分别用毒胡萝卜素（TG）和衣霉素（TM）处理，并通过QPCR和Western Blot技术测得在内质网应激情况下Rcn3基因和RCN3蛋白的表达量。在模型构建成功的情况下，结果表明：1）Rcn3基因的表达量相比对照组均成上升趋势。2）RCN3蛋白的表达量相比对照组均成上升趋势。可得出结论：Rcn3基因及其编码的蛋白RCN3蛋白与内质网应激机制有关。

近年来，生物技术逐渐崭露头角，成为世界科研的主要潮流之一，生物研究的根本便是研究基因和基因所编码的蛋白质的表达情况和在细胞、个体、种群层次上发挥的作用。由于生物技术与食品安全、生物制药等方面的紧密关联性，其具有重大的科研以及商业价值。生物技术也必将在未来为改善人类生活做出更重要、更不可或缺的贡献。

研究背景

Rcn3简介

小鼠Reticulocalbin（Rcn3）是一个单拷贝基因，基因序列号是BC055903，位于小鼠的第7号染色体上，包含有7个外显子，翻译起始位点（ATG）位于第二个外显子上，分布在10kb的染色体范围内（基因组结构示意图如图1[1]），预测编码一个328个氨基酸的多

肽[2]。蛋白结构预测表明，RCN3含有6个

EF-Hand结构域，在C-末端含有一个内质网定位信号HDEL，结构上非常保守，属于近年来新发现的一个含6个EF-hand结构域，定位内质网中的钙离子结合蛋白家族Reticulocalbin。关于Rcn3的研究还很少，其基因功能仍然很不清楚。

内质网应激

内质网（endoplasmic reticulum， ER）是真核细胞内非常重要的多功能细胞器，在完成基本生理功能的同时，内质网凭借其庞大的膜结构成为协调信号转导的枢纽平台，内质网是脂类和固醇合成、维持Ca2+动态平衡、蛋白质合成与折叠及其翻译后修饰的场所[3-4]。

遗传或环境损伤会引起细胞内钙稳态失衡、氧化应激、营养缺乏、糖基化抑制和蛋白质错误折叠，从而破坏内质网功能，诱发内质网应激[3-6]。本次研究使用毒胡萝卜素（thapsigargin， TG）、衣霉素（tunicamycin， TM）处理小鼠胚胎成纤维细胞，从而诱导细胞产生内质网应激过程。

TG原理：TG是内质网Ca2+-ATP酶选择性抑制剂，可以使胞质内Ca2+浓度升高。

TM原理：TM阻碍了蛋白中N-糖苷键的

形成。

图1 小鼠RCN3蛋白质序列，EF-Hand结构域和蛋白结构示意图

A：预测的小鼠RCN3氨基酸序列，红色序列代表信号肽，蓝色序列是预测的6个保守的EF-Hand结构域。B：对应于A中的6个在CREC家族中非常保守的EF-Hand结构域。C：RCN3蛋白结构示意图。

研究目的与意义

Tsuji A. 等人发现，人的RCN3蛋白严格定位于内质网，具有Ca2+结合活性[2]，且其具体功能尚不明确，故选择RCN3作为研究对象。

本次实验利用已有的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为实验材料，通过TG和TM的处理，诱导细胞建立内质网应激模型。然后通过荧光定量PCR法（QPCR）和免疫印迹法（Western Blot）檢测在内质网应激条件下，Rcn3基因和蛋白的表达量，从而得出Rcn3与内质网应激机制是否存在关联。

Rcn3是通过生物信息学预测出来的基因，RCN3在人，大鼠，小鼠中都存在同源蛋白，并且小鼠RCN3和人RCN3的氨基酸同源性高达93% [1]。故通过对小鼠体内Rcn3基因与内质网应激机制是否关联的研究，我们可以检测或推断出人类Rcn3与内质网应激机制的关联性，从而对未来生命科学和生物制药等方面的研究奠定一定的理论研究基础。

实验方法与步骤

RNA的提取

1）准备试剂：氯仿、异丙醇、75℅乙醇、无RNase的水。

操作步骤：

（1）单层培养细胞：在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积加1mL。

（2）将匀浆样品在室温（15℃～30℃）放置5min，至核酸蛋白复合物完全分离。

（3）每使用1mLTRIzoL加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min。4℃12000r离心15min。

（4）把上层水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA，4℃放置30min，4℃12000r离心10min，弃去上清。

（5）用75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃12000r离心5min，弃上清。

（6）室温放置干燥RNA沉淀10min。加入30μl无RNase的水，55℃放置10min使RNA溶解，-70℃保存。

2）RNA反转录。

采用试剂盒为 HiFiScript cDNA Synt

hesis Kit（CWBIO），根据指导手册进行 cDNA 合成。

（1）模板 RNA Total RNA 3μg

Primer Mix（50 μL） 1μL

dNTP Mixture （10 mM each） 1μL

RNase-free water Up to 13μL

70℃ 保温 10min 后， 冰上迅速冷却。

（2）上述反应液 13μL

5×RT Buffer 4μL

DTT 2μL

HiFiScript（200U/μL） 1μL

Total：20μL

（3）混匀后，50℃反应15min。

（4）85℃，5 min 使酶灭活，冰上冷却。

3）QPCR 体系。

MASTER MIX 5μl

正向引物（ 10μM） 0.5μl

反向引物（ 10μM） 0.5μl

DNA模板 50ng

ddH2O to 10μl

反应条件：94℃，60s变性模板DNA；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃， 1min/kb；35 cycles。68℃，10min；4℃，保存。

4）Western Blot实验检测蛋白质的表达。

（1）去离子水清洗1.5mm规格玻璃板，晾干待用。

（2）配胶：配制12%分离胶，用去离子水排气泡封胶。胶已凝固时（约30min），倾去胶上的水后洗涤数次，并用滤纸将水吸干。配制5%的浓缩胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后立即将干净且干燥的梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后（约30min），将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，排除凝胶底部两块玻璃板之间的气泡，拔出梳子。

（3）蛋白上样：电泳液冲洗浓缩胶上样孔，水浴锅煮沸去离子水，煮蛋白5min使之变性，立即冰浴，然后低速离心5min，进行蛋白上样。

（4）电泳：将电泳槽与电泳仪相接，跑浓缩胶时用80V电压，到分离胶后改为120V直至蛋白跑至胶底。

（5）转膜：半干法：从负极到正极方向依次为纤维垫、凝胶、PVDF膜、纤维垫，用转膜液湿润即可，限压（20V）、限流（5.5倍胶面积mA）转膜1小时。

（6）将膜用1×丽春红染液染5min，去离子水轻轻冲洗，观察蛋白转膜情况，并根据目的蛋白位置裁剪PVDF膜，TBST洗去染液。

（7）封闭：将膜移入盛有5%脱脂奶粉的平皿中，室温摇床孵育1h，TBST洗膜。

（8）孵育一抗：用5%脱脂奶粉稀释一抗，湿盒中4℃恒温房摇床过夜。

（9）孵育二抗：倾去一抗，TBST室温摇床洗膜3～5次，每次5min～10min，5%脱脂奶粉稀释相应二抗，室温摇床孵育3h。

（10）曝光：倾去二抗，TBST室温摇床洗膜3～5次，每次5min～10min。将两种发光剂按1：1的比例混合，避光孵育膜上蛋白2min～5min，倾去发光剂，准备显影。

（11）显影：整个过程在暗室中。将胶片压于已封发光剂的蛋白膜上，取出胶片后在显影液中浸洗，适时在水中终止，将胶片放入定影液中定影，之后用水将胶片冲洗干净，吹干。

结果与分析

QPCR结果

图2

A：Rcn3敲除小鼠成纤维细胞TM处理后GRP78 mRNA表达情况。B：Rcn3敲除小鼠成纤维细胞TG处理后GRP78 mRNA表达情况。C：野生型小鼠成纤维细胞TM处理后GRP78 mRNA表达情况。D：野生型小鼠成纤维细胞TG处理后GRP78 mRNA表达情况。与对照组相比，所有处理样本的GRP78 mRNA表达量上升。

图3

A：野生型小鼠成纤维细胞TG处理后Rcn3 mRNA表达情况。B：野生型小鼠成纤维细胞TM处理后Rcn3 mRNA表达情况。与对照组相比较，所有处理组样本的Rcn3 mRNA表达量呈现上升趋势。

Western Blot结果

图4

免疫印迹法测得野生型和Rcn3基因敲除小鼠成纤维细胞在TM 和TG 处理后内参蛋白（β-BUTULIN）、GRP78蛋白、RCN3蛋白表达情况。 内参蛋白表达情况大体相同，说明上样量基本一致。通过对比可知，在内质网应激情况下，RCN3蛋白表达量上升。

结论与展望

结论

1）所有小鼠成纤维细胞的GRP78 mRNA表达量均成上升趋势，可得出结论：所有细胞内质网皆产生应激反应即ER stress模型建立

成功。

2）所有小鼠成纤维细胞的Rcn3 mRNA表达量均成上升趋势，可得出结论：小鼠成纤维细胞内Rcn3基因与内质网应激反应有关联，在内质网受到刺激的情况下，Rcn3基因表达量上升。

3）所有小鼠成纤维细胞的RCN3蛋白表达量均成上升趋势，可得出结论小鼠细胞内RCN3蛋白与内质网应激机制有关联，与mRNA表达量变化趋势大致相同。

展望

1）通过更改刺激内质网的药品和内质网所处的环境，并多次重复实验，进一步确定Rcn3基因和RCN3蛋白是否与内质网应激机制存在关联性。

2）通过对RCN3蛋白肽链组成、空间结构等方面的探究，揭示该种蛋白及编码其的基因在内质网应激条件下发挥的具体作用。

本次研究通过建立模型法成功证实了还未被广泛研究和重视的Rcn3基因及其编码的RCN3蛋白与内质网应激机制具有显著的相关性。在未来，通过对此种基因的进一步研究和利用可以为生命科学的研究和利用做出更多、更重要的贡献。

参考文献

[1]张一荻.Rcn3基因功能探究[D].北京：中国科学院大学，2013.

[2]Tsuji， A. Kikuchi， Y. Sato， Y. Koide， S. Yuasa， K. Nagahama， M. and Matsuda， Y （2006）. A proteomic approach reveals transient association of reticulocalbin-3， a novel member of the CREC family， with the precursor of subtilisin-like proprotein convertase， PACE4[J]. Biochem 396，51-59.

[3]Paschen， W. Frandsen， A. Endoplasmic reticulum dysfunction a common denominator for cell injury in acute and degenerative diseases of the brain[J]. Neurochem， 2001，79（4）：719-725.

[4]Schroder， M. Kaufman， R. ER stress and the unfolded protein response[J]. Mutat Res，2005，569（1-2）：29-63.

[5]Zhang H Y. Wang Z G. Lu X H. et al. Endoplasmic reticulum stress： relevance and therapeutics in central nervous system diseases[J]. Mol Neurobiol，2015，51（3）：1343-1352.

[6]Breckenridge D G， Germain M，Mathai J P，et al.Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways. Oncogene，2003，22（53）：8608-8618.

（通讯作者：马润林，教授，博士生導师，中国科学院大学，研究方向为人类及动物功能基因组学。

石小倩，博士，中国科学院大学，研究方向为遗传学。

作者简介：陈学正，王清华，杨东奇，北京市牛栏山第一中学。）